1. Trang chủ >
  2. Luận Văn - Báo Cáo >
  3. Nông - Lâm - Ngư >

Ứng dụng Kỹ thuật Real - time PCR

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.5 MB, 91 trang )


23 ban đầu. Khi phản ứng Real - time PCR kết thúc, giá trị chu kỳ ngưỡng của mẫu xét
nghiệm và của các chuẩn được xác định ở thời điểm có sự tương quan tuyến tính giữa số chu kỳ và nồng độ huỳnh quang đo được pha log hay pha cấp số. Tại thời điểm
này, đường baseline subtracted đường đã trừ đi tín hiệu nền phải cắt tất cả các đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang đo được và số chu kỳ. Tại vị trí cắt
này, tín hiệu huỳnh quang vượt qua tín hiệu nền rõ rệt. Chu kỳ ngưỡng của mẫu và chuẩn được xác định tại vị trí đó.
Đường chuẩn được hình thành dựa vào chu kỳ ngưỡng đã được xác định ở trên và nồng độ bản sao của các chuẩn đã biết. Chu kỳ ngưỡng của mẫu xét nghiệm được đối
chiếu qua chu kỳ ngưỡng của các chuẩn nằm trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa log số bản sao ban đầu và chu kỳ ngưỡng. Kết quả đối chiếu này sẽ cho giá trị log
số bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm qua phương trình Y = a.X + b trục Y: chu kỳ ngưỡng, trục X: log số bản sao ban đầu. Từ giá trị log số bản sao ban đầu này ta sẽ
quy đổi ra số bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm.

2.4.3.7. Ƣu và nhƣợc điểm


Ưu điểm của kỹ thuật này là khả năng định lượng chính xác số ADN tham gia phản ứng, quan sát trực tiếp tiến trình khuếch đại đang diễn ra theo từng chu kỳ khi phản
ứng Real - time PCR xảy ra Bio – Rad, 2004. Ngồi ra, Real - time PCR còn thể hiện một số ưu điểm nổi bật Nguyễn Thái Thủy, 2003:
- Không cần điện di sau khi thực hiện phản ứng Real - time PCR. - Quy trình đơn giản, tiến trình thực hiện nhanh, rút ngắn thời gian cho kết quả.
- Độ nhạy cao. - Độ đặc hiệu cao.
- Ống phản ứng PCR ln ln đóng, tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Tuy nhiên Real - time PCR đòi hỏi phòng thí nghiệm phải có trang thiết bị máy
hiện đại, giá thành khá cao.

2.4.3.8. Ứng dụng


Real - time PCR cũng được ứng dụng vào trong các lĩnh vực tương tự như PCR truyền thống. Nhờ khả năng thu nhận tín hiệu huỳnh quang tương ứng với số ADN
đích ở pha cấp số, Real - time PCR được mở rộng thêm nhiều ứng dụng mới và hiệu quả hơn PCR truyền thống Applied Biosystems, 2004:
24 - Định lượng hàm lượng virus.
- Định lượng mức độ biểu hiện gen. - Phát hiện tác nhân gây bệnh.
- Xác định kiểu gen genotyping. - Ứng dụng hiệu quả trong trị liệu thuốc.
Đối với tác nhân gây bệnh là virus, Real - time PCR đóng vai trò rất quan trọng trong phát hiện và định lượng tác nhân gây bệnh này. Virus gây bệnh đốm trắng trên
tôm nuôi đang là mối quan tâm chung của ngành Thủy sản. Một trong những ứng dụng đáng được quan tâm hiện nay đó là sử dụng kỹ thuật Real - time PCR trong phát hiện
và định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi.
25

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1. Thời gian thực hiện
Đề tài được thực hiện từ ngày 01 03 05 đến ngày 01 08 05.

3.1.2. Địa điểm thu mẫu


Mẫu tôm giống, mẫu tôm nuôi thương phẩm, mẫu tôm bố mẹ được thu từ các hộ nuôi tôm, các trại tôm giống ở các tỉnh Bến Tre và Bạc Liêu, các chi cục Bảo Vệ
Nguồn Lợi Thủy Sản Bến Tre và Bạc Liêu, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.

3.1.3. Địa điểm phân tích mẫu


Đề tài được thực hiện tại Công Ty Nam Khoa và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh.

3.2. Nội dung nghiên cứu


- Thu nhận mẫu tôm đã qua xét nghiệm dương tính, âm tính với virus gây bệnh đốm trắng ở các chi cục Bảo Vệ Nguồn Lợi Thủy Sản Bến Tre và Bạc Liêu, Viện
Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II và mẫu tôm thu từ thực tế ở các ao nuôi tôm ở các tỉnh Bến Tre và Bạc Liêu.
- Thử nghiệm hai quy trình ly trích ADN sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và ly trích ADN sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix.
- Kiểm tra phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên 15 mẫu đã xác định dương tính, âm tính với WSSV thơng qua thử nghiệm bằng phương pháp Real - time PCR.
- Khảo sát tính định lượng của phương pháp Real - time PCR. - Khảo sát độ nhạy giữa phương pháp Real – time PCR và Non Stop Nested PCR.
- Ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế.
- Theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao ni tôm đã được thu mẫu kiểm tra.
3.3. Nguyên vật liệu 3.3.1. Mẫu xét nghiệm
- Mẫu tôm giống - Mang, chân bò, chân bơi của tơm ni thương phẩm và tơm bố mẹ.

Xem Thêm
Tải bản đầy đủ (.pdf) (91 trang)

×