1. Trang chủ >
  2. Luận Văn - Báo Cáo >
  3. Nông - Lâm - Ngư >

Tiến hành ly trích

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.5 MB, 91 trang )


29 dịch tách chiết pha xong bảo quản trong bình tối, nắp vặn chặt, có thể lưu trữ trên 3
tháng.

3.4.2.2. Tiến hành ly trích


Ly trích sử dụng SDS, NaOH và sốc nhiệt Nguyên tắc của việc ly trích này là dựa trên sự phối hợp cơ học nghiền, hóa học
NaOH, SDS và sốc nhiệt để tách chiết ADN virus ra dịch chiết. Quy trình tách chiết bao gồm các bước sau:
- Cho mẫu tôm vào ống eppendorf 1,5 ml, thêm vào 100 µl dung dịch tách chiết, rồi dùng chày nhỏ nghiền nhuyễn. Sau đó tiếp tục thêm 500 – 700 µl dung dịch tách
chiết, tiếp tục nghiền cho đến khi thấy mẫu được nghiền nhuyễn hoàn toàn có thể gắn chày vào một đầu khoan điện để nghiền cho nhanh. Nếu thao tác nhiều mẫu thì nên
giữ lạnh trên đá cho đến khi chuyển qua bước tiếp theo. - Chuyển các ống nghiệm này sang bếp cách thủy đang sôi, hay lên một bếp nhiệt
khô ở 96 C, giữ yên 5 – 10 phút. Sau đó lấy ra và làm lạnh nhanh các ống nghiệm trên
đá trong vài phút. - Ly tâm 13000 vòng phút trong 5 phút. Sử dụng phần dịch nổi cho phân tích
R e a l - t i m e PCR hoặc bảo quản lạnh ở – 20 C trong vòng một tuần khi mẫu chưa
được phân tích ngay. Ly trích sử dụng SDS, NaOH và sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix
Sau khi ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt. Tiến hành sử dụng bộ ly trích Instagene Matrix để tinh sạch và thu nhận nhiều ADN. Quy trình như sau:
- Hút 20 µl phần dịch nổi sau khi ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt cho vào ống eppendorf 1,5 ml. Sau đó thêm 200 µl dung dịch Instagene Matrix đã được khuấy
từ trước đó 15 phút vào trong ống. - Tiến hành ủ ở nhiệt độ 56
o
C trong vòng 15 - 30 phút, lấy ra vortex đảo mạnh 10 giây.
- Tiếp tục ủ 100
o
C trong 8 - 10 phút, lấy ra vortex mạnh 10 giây. - Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút. Sử dụng phần dịch nổi để phân tích Real - time
PCR hay bảo quản lạnh - 20
o
C trong vòng một tuần.
30
3.4.3. Tiến hành thực hiện Real - time PCR 3.4.3.1. Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Real - time PCR
- Cho 2 µl dịch ly trích ADN cần phân tích vào các ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR để đạt thể tích phản ứng sau cùng là 50 l.
- Đối chứng âm: cho 2 µl đối chứng âm vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR.
- Đối chứng dương: cho 2 µl đối chứng dương vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR.
- Đối với chuẩn: sử dụng 5 chuẩn có hàm lượng bản sao WSSV theo thứ tự lần lượt từ 10
5
bản sao 2 µl; 10
4
bản sao 2 µl; 10
3
bản sao 2 µl; 10
2
bản sao 2 µl; 10
1
bản sao 2 µl. Đối với mỗi chuẩn, dùng micropipette hút 2 µl từng chuẩn cho vào mỗi ống
eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR.
3.4.3.2. Thiết lập chƣơng trình thực hiện Real - time PCR trên phần mềm máy iCycler iQ
Thiết lập chương trình luân nhiệt: chương trình luân nhiệt được thiết lập dựa trên các thanh công cụ trên phần mềm iQ version 3.1 như sau:
Chu kỳ 1: lặp lại 1 lần Bước 1: 95
o
C 3 phút 30 giây Chu kỳ 2: lặp lại 45 lần
Bước 1: 95
o
C 15 giây Bước 2: 60
o
C 1 phút Thiết lập vị trí đặt mẫu: chọn tên mẫu cần thiết lập: mẫu cần xét nghiệm
unknown, chuẩn standard, đối chứng - và +. Sau đó chọn vị trí đặt mẫu trên buồng đĩa 96 giếng qua màn hình vi tính.
Định tên mẫu: mẫu được định tên tương ứng với số thứ tự mẫu hay nguồn gốc mẫu để thuận tiện cho phân tích kết quả.
Chọn chất chỉ thị màu huỳnh quang: chọn FAM và màu hiển thị cho FAM. Định nồng độ các chuẩn: định tên và nồng độ 10
5
bản sao 2 µl đến 10
1
bản sao 2 µl tương ứng với vị trí 5 chuẩn đã được thiết lập trên buồng đĩa.
31

3.4.3.3. Chạy Real - time PCR


Xem Thêm
Tải bản đầy đủ (.pdf) (91 trang)

×