1. Trang chủ >
  2. Luận Văn - Báo Cáo >
  3. Nông - Lâm - Ngư >

Non Stop Nested PCR

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.5 MB, 91 trang )


39
Kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR sẽ được phân tích chủ yếu dựa trên: số bản sao ban đầu SQ, giá trị chu kỳ ngưỡng Ct. Nếu có sự lặp lại các mẫu, kết quả
còn được phân tích qua số bản sao trung bình SQ Mean, giá trị chu kỳ ngưỡng trung bình Ct Mean, độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu SQ SD, độ lệch chuẩn của chu
kỳ ngưỡng Ct SD. Các cột còn lại ở Bảng 3.1 nhằm thể hiện vị trí đặt mẫu, loại mẫu,…giúp người phân tích biết rõ thơng tin về mẫu cần kiểm tra.

3.4.5.2. Non Stop Nested PCR


Kết quả sau khi thực hiện Non Stop Nested PCR được phân tích dựa trên kích thước đoạn khuếch đại đặc hiệu và thang ADN chuẩn qua quan sát các băng ADN dưới tia
sáng của đèn UV hay bằng máy phân tích điện di GelDoc iQ của Bio – Rad. Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu của WSSV khi chạy Non Stop Nested PCR là đoạn
có kích thước 633 bp và 221 bp. Dựa vào thang ADN chuẩn, xác định sự hiện diện băng điện di của đoạn 633 và 221 bp ở đối chứng dương. Sau đó so sánh băng điện di
của mẫu với hai băng đặc hiệu trên để xác định mẫu dương tính hay âm tính với WSSV.
Well Type Identifier Rep Ct
Log SQ
SQ SQ
Ct Ct
SQ Mean
SD Mean SD
A01 A03
A05 A07
A09
Bảng 3.1 Bảng kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR
Well: vị trí giếng Type: loại mẫu
Identifier: định tên mẫu Rep: vị trí mẫu trên 96 giếng
Ct: chu kỳ ngưỡng SQ: starting quantity: số bản sao ban dầu
SD: standard deviation: độ lệch chuẩn Mean: trung bình
40
3.5. Bố trí thí nghiệm 3.5.1. Thí nghiệm 1: thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc
nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix
Để ly trích ADN, có hai quy trình đã được thử nghiệm: - Quy trình 1: ly trích ADN sử dụng SDS, NaOH, và sốc nhiệt.
- Quy trình 2: ly trích ADN sử dụng Instagene Matrix sau khi đã ly trích bằng SDS, NaOH, và sốc nhiệt.
Mục đích Khảo sát hai quy trình ly trích nhằm tìm ra quy trình ly trích tối ưu.
Tiến hành Sử dụng mẫu tơm nhiễm WSSV với mức độ nặng đã qua xét nghiệm được lưu trữ
tại công ty Nam Khoa để tiến hành tách chiết ADN theo hai quy trình ly trích chi tiết ở mục 3.4.2. Sau khi ly trích xong, dịch tách chiết ADN được pha loãng theo hệ số
pha loãng bậc 10. Dùng micropipette hút 5 µl dịch tách chiết ADN cho vào 45 µl dung dịch TE 1X Tris EDTA, tiến hành trộn mẫu trên máy vortex, sau đó hút 5 µl mẫu từ
ống eppendorf vừa vortex ở trên chuyển sang ống eppendorf thứ hai có chứa sẵn 45 µl TE 1X, trộn đều. Quá trình cứ lặp lại, cuối cùng ta thu được một dãy các nồng độ
ADN theo chiều giảm dần từ 10 đến 10
-6
Hình 3.8. Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR cho tất cả các nồng độ từ 10
-1
đến 10
-6
của cả hai quy trình ly trích.
633bp 221bp
Hình 3.7 Kết quả điện di qua Non Stop Nested PCR
MK: thang ADN chuẩn
41
Dựa vào kết quả so sánh chu kỳ ngưỡng của mẫu ở từng nồng độ pha lỗng theo
hai quy trình ly trích để xác định mẫu ly trích theo quy trình nào sẽ có ADN đích nhiều và tinh sạch hơn mẫu có ADN đích nhiều và tinh sạch hơn sẽ có chu kỳ ngưỡng thấp
hơn.
3.5.2. Thí nghiệm 2: sử dụng phƣơng pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện và định lƣợng virus gây bệnh đốm trắng WSSV trên 15 mẫu đã xác định dƣơng
tính, âm tính với WSSV
Mục đích Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lượng WSSV bằng phương pháp Real - time
PCR. Tiến hành
15 mẫu tôm 8 mẫu dương tính và 7 mẫu âm tính với WSSV đã qua kiểm tra PCR và Semi – Nested PCR được tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1.
Các mẫu này được thử nghiệm lặp lại hai lần qua Real - time PCR và đồng thời một lần qua Non Stop Nested PCR. Các mẫu tôm sau khi ly trích này được chạy kèm với 5
chuẩn. Sau khi ly trích xong, dùng micropipette hút 2 µl dịch tách chiết chứa ADN của WSSV cho vào từng hỗn hợp 48 µl Real - time PCR và hỗn hợp 48 µl Non Stop
Nested PCR. Đối với chuẩn, hút 2 µl mỗi chuẩn cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR và Non Stop Nested PCR chi
tiết ở mục 3.4.3 và 3.4.4. Mẫu nào có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường baseline
subtracted được xác định là dương tính với WSSV. Mẫu nào có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang nằm dưới đường baseline subtracted được xác định là âm tính với
5 µl mẫu
45 µl TE
10 10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-1
5 µl 5 µl
5 µl 5 µl
5 µl 5 µl
Hình 3.7 : Cách pha loãng mẫu theo hệ số pha loãng bậc 10
Hình 3.8 Cách pha lỗng mẫu theo hệ số pha loãng bậc 10
10 10
-1
10
-4
10
-3
10
-2
10
-5
10
-6
42 WSSV. Kết quả chạy Real - time PCR được đối chiếu với kết quả chạy Non Stop
Nested PCR và so sánh với kết quả đã xét nghiệm trước đó bằng phương pháp PCR và Semi – Nested PCR. Số bản sao ban đầu của WSSV được định lượng dựa trên đường
chuẩn và cho kết quả ở bảng số liệu xuất kết quả sau khi chạy mẫu.
3.5.3. Thí nghiệm 3: khảo sát tính định lƣợng của phƣơng pháp Real - time PCR
Mục đích Khảo sát tính tuyến tính và độ lặp lại về khả năng định lượng của phương pháp
Real - time PCR. Tiến hành
Chọn ngẫu nhiên hai mẫu nhiễm virus gây bệnh đốm trắng ở mức độ nặng từ thí nghiệm 2, tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Sau khi ly trích
xong, pha loãng dịch tách chiết ADN của hai mẫu này theo hệ số pha loãng bậc 10 giống như tiến hành pha lỗng mẫu ở thí nghiệm 1 được một dãy các nồng độ ADN
theo chiều giảm dần từ 10 đến 10
-3
. Thực hiện phản ứng Real - time PCR ở các nồng độ pha loãng của cả hai mẫu: ở nồng độ bắt đầu pha loãng 10
và ở mỗi nồng độ pha loãng 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
tiến hành lặp lại 3 lần. Khi thực hiện Real - time PCR, 5 chuẩn được chạy kèm để định lượng số bản sao của WSSV theo từng nồng độ pha loãng. Ở
từng nồng độ pha lỗng, 2 µl mẫu đã vortex được cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Đối với chuẩn, 2 µl mỗi chuẩn được cho vào từng 48 µl hỗn hợp Real - time
PCR. Dựa vào các đường biễu diễn nồng độ huỳnh quang ở từng nồng độ trên đồ thị biểu
diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, độ sai khác của các giá trị chu kỳ ngưỡng ở các nồng độ, độ lệch chu kỳ ngưỡng trung bình và độ lệch giữa các
số bản sao trung bình ở các nồng độ pha lỗng qua 3 lần lặp lại để xác định tính tuyến tính về khả năng định lượng của Real - time PCR. Căn cứ vào đường biểu diễn nồng
độ huỳnh quang ở 3 lần lặp lại của từng nồng độ mẫu pha loãng, log số lượng bản sao ban đầu của mẫu ở từng nồng độ pha loãng trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn, độ sai
khác chu kỳ ngưỡng của 3 lần lặp lại ở cùng nồng độ pha loãng, độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu qua 3 lần lặp lại để xác định độ lặp lại về khả năng định lượng của
Real - time PCR.
43
3.5.4. Thí nghiệm 4: khảo sát độ nhạy giữa phƣơng pháp Real - time PCR và Non Stop Nested PCR
Mục đích So sánh độ nhạy giữa hai phương pháp để khẳng định tính vượt trội về độ nhạy của
phương pháp Real - time PCR nhằm sử dụng để kiểm tra phát hiện WSSV trên các mẫu thu từ thực tế.
Tiến hành Sử dụng mẫu tôm nhiễm WSSV nặng lưu trữ tại công ty Nam Khoa và tiến hành ly
trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Sau khi ly trích xong, dịch tách chiết ADN được tiến hành pha loãng theo hệ số pha loãng bậc 10, được một dãy các nồng
độ ADN bản mẫu theo chiều giảm dần từ 10 đến 10
-8
. Sau đó thực hiện phản ứng Real - time PCR và Non Stop Nested PCR ở các nồng độ 10
-1
đến 10
-8
. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần với cả hai phương pháp trên cùng một mẫu ở tất cả các nồng độ pha
lỗng. 2 µl dịch tách chiết ADN WSSV ở từng nồng độ pha loãng được cho vào đồng thời từng hỗn hợp 48 µl Real - time PCR và hỗn hợp 48 µl Non Stop Nested PCR. Sản
phẩm khuếch đại của hai phương pháp được phân tích trên phần mềm iQ version 3.1 và trên gel agarose 2.
Dựa vào đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ xem khả năng phát hiện WSSV của phương pháp Real - time PCR đến nồng độ pha loãng
nào. Căn cứ vào hình điện di sản phẩm qua Non Stop Nested PCR để xác định khả năng phát hiện WSSV của Non Stop Nested PCR đến nồng độ pha lỗng nào. Qua đó
so sánh khả năng phát hiện WSSV đến nồng độ mẫu pha loãng nào của hai phương pháp để xác định độ nhạy giữa Real - time PCR và Non Stop Nested PCR. Phương
pháp nào có độ nhạy cao hơn sẽ có khả năng phát hiện WSSV đến nồng độ pha lỗng thấp hơn.
3.5.5. Thí nghiệm 5: ứng dụng phƣơng pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế
Mục đích Ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra sơ khởi tỷ lệ nhiễm WSSV
trên tôm sú giống, và kiểm tra mức độ nhiễm WSSV trên tôm nuôi thương phẩm và tôm bố mẹ.
44 Tiến hành
30 mẫu tôm thu thực tế từ vùng nuôi tôm ở Bến Tre và Bạc Liêu được tách chiết ADN qua quy trình ly trích xác định từ thí nghiệm 1. Các mẫu này được chạy kèm với
5 chuẩn để định lượng số bản sao ban đầu của virus gây bệnh đốm trắng. Thí nghiệm này được lặp lại 2 lần qua Real - time PCR. Sau khi ly trích xong, 2 µl mẫu được cho
vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Đối với chuẩn, 2 µl mỗi chuẩn được cho vào từng hỗn hợp 48 µl Real - time PCR. Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR.
Dựa vào đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang của các mẫu trên đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ và các hiển thị của mẫu trên đồ
thị biểu diễn đường chuẩn để xác định là mẫu dương tính hay âm tính với WSSV và số lượng bản sao ban đầu của WSSV.
3.5.6. Thí nghiệm 6: theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao ni tơm đã đƣợc thu mẫu kiểm tra
Mục đích Theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao ni có thu mẫu tôm kiểm tra để có
những khuyến cáo phù hợp cho người ni tơm. Tiến hành
Ghi nhận lại kết quả thu hoạch của các ao tôm thả nuôi tôm giống hoặc đang nuôi tôm thương phẩm, sản xuất giống bằng tôm bố mẹ được xét nghiệm bằng phương pháp
Real - time PCR cho kết quả âm tính và dương tính với WSSV. Qua đó đánh giá khả năng thành công của các ao thả nuôi tôm bị nhiễm WSSV.
45

Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


4.1. Kết quả thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix
Đối với quy trình ly trích 2, tín hiệu huỳnh quang thu được ở chu kỳ ngưỡng lần lượt là: 16,9; 20,6; 23,7; 27,1; 30,6; 34,8 tương ứng với nồng độ mẫu pha lỗng từ 10
-1
đến 10
-6
. Quy trình ly trích 1 cho kết quả tín hiệu huỳnh quang thu được ở chu kỳ ngưỡng: 20,6; 23,8; 27,5; 31,6; 34,9; 37,8 tương ứng với nồng độ pha loãng từ 10
-1
đến 10
-6
. Kết quả cho thấy, số chu kỳ ngưỡng tăng dần theo chiều giảm dần của nồng độ pha loãng. Ở nồng độ 10
-1
đến 10
-6
của mẫu qua quy trình ly trích 2 có chu kỳ ngưỡng thấp hơn so với chu kỳ ngưỡng của mẫu qua quy trình ly trích 1 ở các nồng độ
Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của mẫu ly trích theo quy trình 1 và 2

: mẫu ly trích theo quy trình 1

: mẫu ly trích theo quy trình 2
 :
đối chứng âm
 ,

: 10
-1
 ,

: 10
-2
 ,

: 10
-3
 ,

: 10
-4
 ,

: 10
-5
 ,

: 10
-6

Xem Thêm
Tải bản đầy đủ (.pdf) (91 trang)

×