1. Trang chủ >
  2. Luận Văn - Báo Cáo >
  3. Khoa học tự nhiên >

Nuôi cấy rễ tơ

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1015.25 KB, 50 trang )


trong môi trường rắn Nitsch và Nitsch NN Nitsch và Nitsch 1969 được bổ sung thêm kinetin, bezyladenine, indole-3-butyric acid IBA và IAA kết hợp với nhau. Sau 2 tháng
nuôi cấy những cây con có rễ được cắt và chuyển vào môi trường mới. Những cây này phải gồm có chồi ngọn hoặc chồi nách. Khoảng 200 cây con đang mọc rễ hình 17a, b
đã được thu từ một cây con. Sau đó chúng sẽ phát triển trong nhà mái vòng bằng nhựa và trong nhà kính hình 1c. Sau 5 tháng sinh trưởng chúng được thu nhận, sấy và cân.
Việc phân tích thành phần hóa học của lá được thực hiện. Vindoline và catharanthine chiếm ưu thế trong giai đoạn còn non của cây trước khi ra hoa. Hàm lượng alkaloid
tổng trong lá của những cây được nuôi cấy in vitro rồi mới chuyển sang môi trường đất thì cao hơn những cây trồng chỉ trong đất.
Hình 18: Sản phẩm mô sẹo và cây mọc từ hạt nhân tạo
a Cây C.roseus đã mọc rễ phát triển từ mô phân sinh ngọn trên môi trường NN bổ sung với 0.1 mgl kinetin và 0.5 mgl IBA sau 1 tuần nuôi cấy.
b Cây C.roseus đang ra hoa phát triển từ mô phân sinh ngọn trên môi trường NN bổ sung với 0.1 mgl kinetin và 0.5 mgl IBA sau 6 ngày chuyển qua.
c Cây C.roseus đang ra hoa trong nhà kính được nhân giống in vitro từ mơ phân sinh ngọn.
d Dòng mơ sẹo màu trắng ni cấy trên môi trường B5 bổ sung với 0.5 mgl kinetin và 1.0 mgl IAA sau 96 ngày chuyển qua.
e Dòng mơ sẹo màu xanh ni cấy trên mơi trường B5 có bổ sung 0.1 mgl kinetin và 1.0 mgl IAA sau 96 ngày chuyển qua

4.2.5 Nuôi cấy rễ tơ


Trong những năm gần đây, phương pháp nuôi cấy rễ, chủ yếu là rễ tơ của C.roseus đã tăng lên đáng kể hơn cả mong đợi, như là một nguồn tiềm năng của những hợp chất
có giá trị chữa bệnh này. Sự phát triển của kỹ thuật vi nhân giống cây và phương pháp
42
để mở rộng việc nuôi cấy rễ in vitro là rất quan trọng và có thể trở thành giải pháp quan trọng để giải quyết việc thu nhận indole alkaloid từ nguyên liệu thô. Những yếu tố di
truyền của rễ tơ, thu được bằng sự nhiễm với Agrobacterium rhizogenes, sản xuất hợp chất thứ cấp nhiều hơn là những cây tự nhiên. Hàm lượng alkaloid trong rễ tơ có thể
tương đương hoặc cao hơn khi đối chiếu với hàm lượng đo được trong nghiên cứu ở rễ tự nhiên. Những alkaloid chiếm ưu thế trong rễ tơ là ajmalicine, serpentine, vidoline và
catharanthine, được tìm thấy với hàm lượng cao hơn trong rễ tự nhiên.
Hình 19: Sản phẩm rễ tơ
a Rễ tơ của C.roseus xuất hiện sau 7-10 ngày ở những chỗ được cảm ứng với Agrobacterium rhizogenes chủng ATCC 15843.
b Rễ tơ của C.roseus nuôi cấy trong môi trường lỏng ½ B5 mà khơng có chất điều hòa tăng trưởng 11 ngày chuyển qua
c Cây C.roseus đã được chuyển gen tái sinh từ rễ tơ trong môi trường lỏng ½ B5 khơng có chất điều hòa sinh trưởng.
d Hạt nhân tạo thu được từ đoạn rễ tơ C.roseus chứa trong gel calcium alginate e Rễ tơ phát triển từ hạt nhân tạo C.roseus nuôi cấy trong môi trường rắn NN có
bổ sung IBA 0.5 mgl và kinetin 0.1 mgl f Rễ tơ phát triển từ hạt nhân tạo C.roseus nuôi cấy trên môi trường rắn NN bổ
sung với IBA 0.5 mgl và BAP 0.1 mgll
43
4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy tế bào C.roseus 4.3.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng
Hirata và cộng sự 1994 đã chứng minh rằng phytohormone hormone thực vật rất quan trọng cho sự tăng trưởng và phân chia hình thái của mơ, dẫn đến sự hình
thành và phát triển của chồi C.roseus, và cũng làm đa dạng hóa các alkaloid và làm tăng hàm lượng của chúng
Tất cả chồi non nuôi cấy của C.roseus được cảm ứng hoàn toàn với tần số cao từ những hạt nảy mầm trên môi trường Murashige và Skoog MS Murashige và Skoog
1962 được bổ sung thêm BA 1.1 mgl Hirata và cộng sự 1987. Kết quả nuôi cấy mặc dù chỉ gồm có mơ sẹo mọc trực tiếp trên mơi trường rắn và có một số chồi non với một
vài lá nhỏ. Theo thông số thu được từ phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu suất cao HPLC của dịch trích ni cấy cho thấy rằng vindoline và catharanthine hiện diện chủ
yếu trong cành non, đặc biệt là trong lá, trong khi ajmalicine 0.072 mgg chất khơ tích lũy chính trong các mô sẹo. Hàm lượng catharanthine 0.370 mgg chất khô trong
lá cây nuôi cấy cao hơn vài lần trong lá của những cây đối chứng 0.035 mgg chất khô, trong khi hàm lựơng vindoline thì gần như bằng nhau trong cả hai trường hợp
lần lượt là 1.8 mgg và 1.2 mgg chất khơ. Khi chuyển q trình ni cấy vào mơi trường khơng có BA đã kích thích sự phát triển của chồi non và dẫn đến sự gia tăng
sản xuất vindoline và catharanthine đồng thời với việc ức chế sản xuất ajmalicine.
Satdive và cộng sự 2003 nghiên cứu ảnh hưởng những nồng độ IAA và BA khác nhau lên sự sản xuất ajmalicine trong bình lắc shake flasks sử dụng chồi C.roseus để
nuôi cấy. Những chồi được ni trong mơi trường MS có bổ sung IAA ở nồng độ cao và BA ở nồng độ thấp, đã tích lũy một lượng lớn ajmalicine. Với IAA ở nồng độ thấp
và BA ở nồng độ cao thì chồi sẽ giải phóng nhiều ajmalicine vào mơi trường. Q trình sản xuất ajmalicine từ chồi ni cấy thì khơng tương quan với tốc độ tăng trưởng.
Vinblastine và vincristine thì khơng hiện diện trong chồi nuôi cấy.
Sự sinh tổng hợp alkaloid xảy ra trong lục lạp. Theo đó, sự hình thành những dimeric alkaloid có thể phụ thuộc vào mức độ khác nhau của lục lạp trong tế bào nuôi
cấy in vitro. Loyola-Vargas và cộng sự 1986 đã thử nghiệm những chất điều hòa sinh trưởng khác nhau và ảnh hưởng của chúng lên việc cảm ứng mơ sẹo xanh trong một
dòng tế bào C.roseus 3 năm tuổi. Các tác giả đã xác định được cả vinblastine và vincristine trong cả hai dòng mơ sẹo trắng và xanh. Hàm lượng của những alkaloid này
trong dòng màu trắng cao hơn xấp xỉ 2 lần trong dòng màu xanh. Trong mơi trường có bổ sung 3 mgl benzylaminopurine BAP mà khơng có mặt auxin đã sản xuất hàm
lượng chất diệp lục cùng với việc gia tăng hàm lượng dimeric alkaloid.
Điều kiện nuôi cấy mô sẹo rất quan trọng cho việc sản xuất alkaloid. Morris 1986 đã thiết lập q trình ni cấy mơ sẹo từ lá của những cây C.roseus sử dụng 3
loại môi trường: môi trường Gamborg B5, môi trường MS và Zenk với những thay đổi khác nhau B5 với 2,4-D 1.0 mgl và kinetin 0.1 mgl; B5 với IAA 1.0 mgl và
kinetin 0.1 mgl; MS với NAA1.0 mgl và kinetin 0.1 mgl, môi trường Zenk bổ sung
44
IAA 0.175 mgl và BAP 1,125 mgl, và chỉ một mình NAA, 2,4-D và zeatin 1.0 mgl. Các tác giả cũng thử tiến hành nuôi cấy trong 2 điều kiện sáng và tối. Các mơ sẹo hình
thành có đặc trưng về màu sắc, hình thái và hàm lượng alkaloid. Bốn loại alkaloid: catharanthine, vindoline, ajmalicine và serpentine đã có mặt trong mơ sẹo ni cấy trên
mơi trường có bổ sung IAA và BAP. Serpentine là alkaloid chính tích lũy trong điều kiện sáng và ajmalicine tích lũy trong điều kiện tối.
Miura và cộng sự 1987 đã cơ lập vinblastine từ mơ sẹo C.roseus hình thành từ những đoạn lá non. Mơi trường MS có bổ sung NAA 1.0 mgl và kinetin 0.1 mgl đã
được sử dụng. Các mô sẹo đã được nuôi cấy trong môi trường tối. Sự hiện diện của vinblastine trong mô sẹo của những rễ khác nhau đã được xác định bằng phương pháp
sắc lý lỏng cao áp HPLC và phép đo phổ khối lượng. Lượng vinblastine 1μgg chất khô, thấp hơn so với cây mẹ.
Marfori và Alejar 1993 đã cho thấy khả năng sản xuất alkaloid của những mô sẹo có nguồn gốc từ rễ, thân, lá và hoa của hai giống C.roseus, trắng và hồng tím. Các tác
giả đã thu được tám dòng mơ sẹo bằng cách sử dụng môi trường LS bổ sung BA 3.0 mgl, 2,4-D 0.5 mgl và nước dừa. Sau khi các mơ được hình thành thì được chuyển
vào mơi trường LS khơng có chất điều hòa sinh trưởng và được ni trồng trong 1 năm. Hàm lượng alkaloid cao nhất là trong cây màu hồng tím và trong mơ sẹo có
nguồn gốc từ rễ.
Theo báo cáo của Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng đăng trên tạp chí phát triển khoa học và cơng nghệ thì mơ sẹo xanh được cảm ứng từ lá cây dừa cạn in vitro được
nuôi trong môi trường MS Murashige và Skoog lỏng có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau gồm có auxin và cytokinin. Ở nồng độ 1 mgl
-1
∝- naphthaleneacetic acid NAA và 0,5 mgl
-1
kinetin Kin thu nhận được sinh khối và alkaloid tồn phần cao nhất trong khi cũng ở mơi trường này nhưng thay thế NAA
bằng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 2,4-D ở cùng nồng độ thu được sinh khối và alkaloid toàn phần thấp.

4.3.2 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng.


Xem Thêm
Tải bản đầy đủ (.doc) (50 trang)

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay
×