1. Trang chủ >
  2. Luận Văn - Báo Cáo >
  3. Khoa học tự nhiên >

Lịch sử phát triển Khái niệm Nguyên tắc

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.5 MB, 91 trang )


16

2.4.2.2. Ƣu và nhƣợc điểm


Theo Phạm Hùng Vân 2002, ưu điểm của phương pháp này là: - Nested PCR có độ nhạy phát hiện vi sinh vật đích rất cao.
- Đối với Nested PCR một bước: sản phẩm PCR lần nhất đã được tính tốn có một lượng vừa đủ để tham gia ngay trực tiếp vào PCR lần hai mà không cần phải mở ống
eppendorf lấy sản phẩm PCR lần nhất cho vào hỗn hợp PCR mới để chạy PCR lần hai, chính nhờ vậy tránh được nguy cơ ngoại nhiễm.
Tuy phương pháp này giúp gia tăng độ nhạy của PCR, nhưng Nested PCR vẫn đòi hỏi nhiều thời gian thực hiện, khơng có khả năng định lượng chính xác số bảo sao của
sinh vật đích và khơng thể theo dõi tiến trình phản ứng đang diễn ra theo từng chu kỳ khuếch đại.

2.4.3. Kỹ thuật Real - time PCR


Một cải tiến nổi bật hơn so với Nested PCR đó là khả năng định lượng chính xác số bản sao ban đầu: Real - time PCR. Phương pháp này cho phép rút ngắn thời gian phân
tích. Khả năng định lượng được kết hợp trong kỹ thuật Real - time PCR đảm bảo giảm thiểu xác suất dương tính giả đối với kết quả phân tích.
Real - time PCR cho phép phát hiện và định lượng mầm bệnh ở mức độ một phân tử copy trên một mẫu. Với độ nhạy cao như vậy phương pháp Real - time PCR cho
phép phát hiện và định lượng virus gây bệnh tôm trước khi xuất hiện các biểu hiện sinh lý.

2.4.3.1. Lịch sử phát triển


Vào năm 1992 – 1993, Higuchi và cộng sự đã tiên phong phân tích PCR kinetic PCR động bằng cách thiết lập hệ thống phát hiện các sản phẩm khuếch đại khi các
sản phẩm này được tích lũy. Hệ thống Real - time bao gồm máy luân nhiệt có hệ thống chiếu mẫu bằng tia UV và tín hiệu huỳnh quang được thu nhận qua CCD charge
coupled device camera. Ethidium bromide được thêm vào trong mỗi hỗn hợp phản ứng Real - time PCR. Khi có sự khuếch đại, số lượng ADN sợi đơi ngày càng tăng,
ethidium bromide xen vào ADN mạch đơi, do đó tín hiệu huỳnh quang tăng lên Weighardt F., 2004.
Ngày nay, các nhà khoa học không ngừng cải tiến kỹ thuật Real - time PCR, đồng thời phát minh ra các chất chỉ thị huỳnh quang: SYBR Green I, FAM, HEX, Texas
Red
®
, Cy
TM
5,…
17

2.4.3.2. Khái niệm


Real - time PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn ADN chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang. Trong phản ứng Real - time PCR,
quá trình nhân bản ADN đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp Newton C. R. and Graham A., 1997.
Real - time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản ADN bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn ADN tạo thành.
Nguyễn Thái Thủy, 2003.

2.4.3.3. Nguyên tắc


Phương pháp dựa trên sự khuếch đại một đoạn ADN đặc hiệu. Sản phẩm khuếch đại được đánh dấu bằng chất chỉ thị màu hay probe gắn huỳnh quang. Trong khi chạy
Real - time PCR, đầu đọc Real - time sẽ phát hiện các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ở bước nhiệt độ trong các chu kỳ nhiệt tùy vào mỗi phương pháp phát hiện tín hiệu màu.
Mẫu xét nghiệm chứa nhiều ADN đích ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng phát hiện sớm hơn là mẫu xét nghiệm có ít ADN đích. Sau khi kết thúc chương trình, phân tích trên
phần mềm và biết được nồng độ tác nhân gây bệnh ban đầu của mẫu xét nghiệm dựa vào các nồng độ ADN chuẩn. Nồng độ ADN trong các mẫu xét nghiệm sẽ được xác
định dựa trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với log số bản sao ban đầu của các mẫu chuẩn.

2.4.3.4. Hệ thống Real - time PCR


Xem Thêm
Tải bản đầy đủ (.pdf) (91 trang)

×