1. Trang chủ >
  2. Luận Văn - Báo Cáo >
  3. Khoa học tự nhiên >

Hệ thống Real - time PCR Phƣơng pháp phát hiện tín hiệu Real - time PCR

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.5 MB, 91 trang )


17

2.4.3.2. Khái niệm


Real - time PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn ADN chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang. Trong phản ứng Real - time PCR,
quá trình nhân bản ADN đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp Newton C. R. and Graham A., 1997.
Real - time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản ADN bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn ADN tạo thành.
Nguyễn Thái Thủy, 2003.

2.4.3.3. Nguyên tắc


Phương pháp dựa trên sự khuếch đại một đoạn ADN đặc hiệu. Sản phẩm khuếch đại được đánh dấu bằng chất chỉ thị màu hay probe gắn huỳnh quang. Trong khi chạy
Real - time PCR, đầu đọc Real - time sẽ phát hiện các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ở bước nhiệt độ trong các chu kỳ nhiệt tùy vào mỗi phương pháp phát hiện tín hiệu màu.
Mẫu xét nghiệm chứa nhiều ADN đích ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng phát hiện sớm hơn là mẫu xét nghiệm có ít ADN đích. Sau khi kết thúc chương trình, phân tích trên
phần mềm và biết được nồng độ tác nhân gây bệnh ban đầu của mẫu xét nghiệm dựa vào các nồng độ ADN chuẩn. Nồng độ ADN trong các mẫu xét nghiệm sẽ được xác
định dựa trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với log số bản sao ban đầu của các mẫu chuẩn.

2.4.3.4. Hệ thống Real - time PCR


Hệ thống Real - time PCR gồm máy luân nhiệt được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính.
Máy vi tính Quang phổ huỳnh quang
Máy ln nhiệt
Hình 2.8 Hệ thống Real - time PCR
Nguồn: Nguyễn Thái Thủy, 2003
18 Hệ thống này hoạt động theo nguyên tắc sau: nguồn sáng chiếu sáng qua kính lọc
kích thích và truyền đến mẫu đã được đặt trên máy luân nhiệt. Ánh sáng kích thích này giúp chất chỉ thị huỳnh quang tương ứng với số ADN đích trong ống phản ứng phát ra
ánh sáng. Ánh sáng huỳnh quang này sẽ qua bộ kính lọc phát sáng. Kính lọc này sẽ chọn lọc các ánh sáng có bước sóng thích hợp. Sau đó, ánh sáng này sẽ qua bộ phận
khuếch đại tín hiệu intensifier, cuối cùng phát hiện nhờ đầu đọc CCD camera.

2.4.3.5. Phƣơng pháp phát hiện tín hiệu Real - time PCR


Tính đặc hiệu của Real - time PCR tùy thuộc hóa chất dùng để theo dõi phản ứng khuếch đại và dụng cụ để kiểm tra tín hiệu. Các hóa chất khác nhau dùng trong mục
đích này Weighardt F., 2004: - Phẩm nhuộm chèn vào ADN sợi đôi sẽ phát huỳnh quang: ethidium bromide,
SYBR Green I. - Probe đặc hiệu có gắn chất phát huỳnh quang: TaqMan probe, Fluorescence
Resonance Energy Transfer FRET probe, Molecular Beacons probe, Scorpions và TaqMan Minor Groove Binder MGB probe.
Các hóa chất được dùng phổ biến hiện nay trong Real - time PCR như sau:
Hình 2.9 Nguyên tắc hoạt động của hệ thống Real - time PCR
KÍNH LỌC KÍCH THÍCH
KÍNH LỌC PHÁT SÁNG
TIA SÁNG LỆCH
Nguồn: Nguyễn Thái Thủy, 2003
19 SYBR Green I
SYBR Green I gắn vào ADN mạch đôi và phát tín hiệu huỳnh quang ở bước sóng 530 nm khi được kích thích bằng ánh sáng có bước sóng 490 nm. Mức độ huỳnh
quang tương ứng với số ADN mạch đôi trong phản ứng McPherson M. J. và Moller S. G., 2001. Đối với SYBR Green I dữ liệu huỳnh quang được thu nhận trong giai đoạn
kéo dài. SYBR Green I gắn vào ADN mạch đôi và phát huỳnh quang sáng gấp 50 đến 100 lần so với khi không gắn kết vào ADN Bio-Rad, 2004.
Hạn chế của SYBR Green I trong phát hiện sản phẩm PCR khuếch đại là sự phát hiện ADN không đặc hiệu. Do mọi phân tử ADN đôi hiện diện trong phản ứng đều
được định lượng, bao gồm các sản phẩm PCR không đặc hiệu và primer – dimer Weighardt F., 2004.
Molecular Beacons probe Molecular Beacons probe được đánh dấu fluorophore chất chỉ thị huỳnh quang ở
cuối đầu 5’và một phân tử quencher chất hấp thụ ở cuối đầu 3’. Molecular Beacons probe gồm: trình tự probe bổ sung với ADN đích loop và hai trình tự bên thân probe
stem với khoảng 5 nucleotide hay nhiều hơn. Trình tự hai bên thân probe stem không bổ sung với ADN đích mà bổ sung lẫn nhau. Khi trình tự hai bên thân probe bắt
cặp với nhau, Molecular Beacons probe có dạng cấu trúc kẹp tóc. Ở dạng này, Molecular Beacons probe mang fluorophore và quencher ở khoảng cách gần, giúp
quencher hấp thụ huỳnh quang từ fluorophore. Khi Molecular Beacons probe gắn vào ADN đích, đầu 5’ và 3’ tách riêng biệt, tín hiệu huỳnh quang được phát ra tương ứng
với số ADN đích tạo thành Bio-Rad, 2004. Ở bước biến tính 95
C, Molecular Beacons probe tách nhau hồn tồn, mở vòng kẹp tóc, tín hiệu huỳnh quang tăng cao. Khi nhiệt độ giảm xuống ở giai đoạn bắt cặp,
Molecular Beacons probe gắn kết với trình tự ADN đích. Các Molecular Beacons probe khơng gắn bổ sung lên trình tự ADN đích sẽ tự bắt cặp lại trở về cấu trúc kẹp tóc
Hình 2.10 SYBR Green I chèn vào ADN sợi đơi
Nguồn: Weighardt F., 2004
20 ban đầu. Do vậy, tín hiệu huỳnh quang ghi nhận được ở giai đoạn này hoàn tồn tương
ứng với lượng ADN đích. Đối với Molecular Beacons probe, dữ liệu huỳnh quang được thu nhận trong giai đoạn bắt cặp Bio-Rad, 2004.
Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET probe FRET dựa vào sự truyền năng lượng từ fluorophore cho sang fluorophore nhận.
Các điều kiện đối với FRET Weighardt F., 2004: - Các phân tử cho và nhận phải ở gần nhau cụ thể 10 – 100 A
. - Phổ hấp thụ của vật nhận phải bao phủ phổ phát quang của vật cho.
- Hướng chuyển đổi giữa vật cho và vật nhận phải đối diện nhau. Hệ thống FRET dựa vào hai chất chỉ thị huỳnh quang, hai chất này khi ở gần nhau
sẽ tạo ra tín hiệu huỳnh quang chuyên biệt. Một chất đánh dấu huỳnh quang được kích thích bởi nguồn sáng và chuyển năng lượng cho chất đánh dấu huỳnh quang thứ hai.
Chất đánh dấu huỳnh quang thứ hai này sẽ phát ra ánh sáng ở bước sóng khác để phát hiện. Probe lai được thiết kế ở dạng một cặp – một probe đánh dấu với màu cho 3’ –
Fluorescine, probe còn lại được đánh dấu với màu nhận 5’ – Red 640 hay 5’ – Red 705. Khi hai probe bắt cặp với đoạn ADN đích thường chúng được tách riêng ra và
bắt cặp vào ở vị trí cách nhau 1 - 5 nucleotide, kết quả sẽ có hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang FRET giữa hai chất chỉ thị huỳnh quang. Hiện tượng
truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang giữa đầu 3’ đánh dấu của probe thứ nhất và đầu 5’ của probe thứ hai nằm kế cận tạo ra tín hiệu huỳnh quang. Nhờ đó tín hiệu
huỳnh quang được ghi nhận tương ứng với số sản phẩm đích. Tín hiệu này được đo bởi thiết bị đo huỳnh quang McPherson M. J. và Moller S. G., 2001.
Hình 2. 11 Nguyên tắc của Molecular Beacons probe
Nguồn: Weighardt F., 2004
21
TaqMan probe TaqMan probe được dùng phổ biến nhất trong các tài liệu về Real - time PCR.
Probe oligonucleotide gắn vào đoạn bên trong ADN đích. Probe này được đánh dấu ở đầu 5’ bằng chất nhuộm chỉ thị huỳnh quang – fluorescent reporter dye gọi là
reporter và chất hấp thụ – quencher ở đầu 3’. Reporter và quencher có phổ kích thích và phát quang trùng nhau. Nhờ đó tín hiệu huỳnh quang được hấp thu. Khi ADN đích
tích lũy, probe gắn vào ADN đích nhưng chưa phát quang. Khi mạch bổ sung với mạch khuôn mà probe bắt cặp được kéo dài, Taq ADN polymerase tiến tới đầu 5’ của
probe. Hoạt tính 5’3’ exonuclease của Taq ADN polymerase sẽ phân cắt đầu 5’ đã được đánh dấu huỳnh quang của probe. Do đó chất chỉ thị huỳnh quang - reporter được
phóng thích ra khỏi sự bắt cặp của chất hấp thụ – quencher và tín hiệu huỳnh quang tăng lên. Mức độ huỳnh quang tương ứng với số ADN chuyên biệt mong đợi. Khác
với SYBR Green I, primer dimer và các sản phẩm ADN khuếch đại khơng đặc hiệu sẽ khơng cho tín hiệu huỳnh quang McPherson M. J. và Moller S. G., 2001.
Như vậy, tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận trong giai đoạn kéo dài. Độ mạnh tín hiệu huỳnh quang tích lũy tăng dần.
Tuy nhiên TaqMan probe cần phải đảm bảo Nguyễn Thái Thủy, 2003: - Chất phát huỳnh quang được chọn làm reporter phải có phổ phát sáng tách biệt
với quencher. - Reporter phát sáng trong khoảng kích thích của quencher.
- Quencher phải nằm gần reporter để hấp thụ hiệu quả. Trong đề tài này, tôi dùng TaqMan probe để bắt cặp với đoạn đặc hiệu 100 bp cần
khuếch đại nhằm phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú. TaqMan probe được đánh dấu ở đầu 5’ bằng chất chỉ thị huỳnh quang FAM đóng vai
trò reporter và 3’ TAMRA đóng vai trò quencher.
Hình 2. 12 Ngun tắc của FRET probe
Nguồn: Weighardt F., 2004
22 TaqMan probe hoạt động theo nguyên tắc cụ thể ở Hình 2.13 như sau:

2.4.3.6. Nguyên lý định lƣợng của kỹ thuật Real - time PCR


Xem Thêm
Tải bản đầy đủ (.pdf) (91 trang)

×