CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

STT Hóa chất, dung mơi

Xuất xứ

99.57%, hãng sản xuất: Chengdu

phần

VCP

Must Biotechnology. Số lô: must –

cung cấp

17020715.

Chất chuẩn loganin. Độ tinh khiết Công ty cổ

14



98%, hãng sản xuất: Weikeqi – phần

Biotech. Số lơ: wkq17112205



VCP



cung cấp



- Các trang thiết bị được trình bày ở Bảng 2.2

Bảng 2.2. Trang thiết bị sử dụng trong phân tích

STT Tên thiết bị

1

Bếp đun cách thủy Bath HH- S4

2

Bếp hồng ngoại Sanaky AT-2521HGN

3

Tủ sấy Memmerk, Shellab

4

Cân phân tích Sartorius – TE214S

5

Cân kỹ thuật Precisa – XB320C

6

Cân phân tích Precisa – 262SMA-FR

7

Máy ly tâm Universal PLC-012E

8

Máy đo độ ẩm Precisa – XM60

9

Máy đo tỷ trọng biểu kiến Erweka

10

Đèn tử ngoại Viber Lourmat

11

Máy HPTLC camag

11

Máy HPLC Shimadzu 20A

12

Kính hiển vi quang học Labomed

Và các dụng cụ, thiết bị khác



Xuất xứ

Trung Quốc

Trung Quốc

Đức

Đức

Thụy Sĩ

Thụy Sĩ

Đức

Thụy Sĩ

Đức

Pháp

Thụy sĩ

Nhật Bản

Mỹ



2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Nghiên cứu điều chế cao đặc

- Mục đích: Khảo sát quy trình điều chế cao đặc hợp lý.

- Cơng thức phương thuốc:

Thục địa

24g

Bạch phục linh

9g

Sơn thù

12g

Trạch tả

9g

Hồi sơn

12g

Cúc hoa

9g

Đơn bì

9g

Câu kỷ tử

9g

- Cao được bào chế từ các dược liệu: Thục địa, Hồi sơn, Sơn thù, Đơn bì, Bạch linh,

Trạch tả, Câu kỷ tử, Cúc hoa

- Chế biến các vị thuốc:



* Thục địa: đã chế biến thành phiến dày 2-3 cm, màu đen tuyền.

* Hoài sơn: đã thái phiến, sao vàng.

* Sơn thù: đã phơi sấy khô.

28



* Đơn bì: Rửa sạch qua nước thật nhanh, thái nhỏ, phơi hoặc sấy khô ở nhiệt độ

50oC – 60oC, sao vàng.

* Bạch phục linh: đã chế biến, sao vàng.

* Trạch tả: đã chế biến thành phiến, sao vàng.

* Cúc hoa: đã phơi sấy khô.

* Câu kỷ tử: đã phơi sấy khô.

- Dung mơi: áp dụng quy trình điều chế cao đặc với dung môi để chiết xuất là nước.

- Dược liệu được thái nhỏ, phối hợp theo đúng tỉ lệ công thức phương thuốc.

- Mỗi mẻ cao cân lượng dược liệu tương ứng 2 thang thuốc ( mtổng = 186g /mẻ).

- Phương pháp: chiết nóng với dung mơi nước theo sơ đồ Hình 2.2:



Dược liệu

Nước



Sắc



Bã dược

liệu



Dịch chiết

nước

Cơ dịch lỗng

trước, dịch đặc sau.

Hàm ẩm dưới 20 %

Cao đặc



Hình 2.2. Sơ đồ bào chế cao đặc chiết nước

 Tiến hành thí nghiệm để lựa chọn thơng số cho quy trình chiết, bao gồm

o Lựa chọn tỉ lệ dược liệu và dung môi nước (DL/N):



29



+ Khảo sát lựa chọn tỷ lệ DL/N lần lượt theo các tỉ lệ thích hợp và tiến hành

trong cùng một điều kiện chiết và điều kiện cô như nhau.

o Lựa chọn thời gian chiết xuất

+ Khảo sát thời gian sắc: Tiến hành chiết cao Kỷ cúc địa hoàng theo các khoảng

thời gian khác nhau với tỷ lệ DL/N đã chọn và trong cùng điều kiện chiết và

điều kiện cô như nhau.

o Lựa chọn số lần chiết xuất

+ Khảo sát số lần sắc: Tiến hành chiết cao Kỷ cúc địa hoàng theo số lần chiết

khác nhau với thời gian chiết, tỷ lệ DL/N đã chọn và trong cùng điều kiện chiết và

điều kiện cô như nhau.

 Xác định khối lượng cao thu được, thể chất cao, chỉ tiêu vật lý, hàm ẩm, pH,

định tính, định lượng hàm lượng hoạt chất chính trong từng mẫu cao [4], [39].

- Tỷ lệ cao chiết được tính theo cơng thức:

H (%) = × 100%

2.2.2. Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc

2.2.2.1. Xác định các tính chất vật lý:



Quan sát, mơ tả tính chất cao đặc về cảm quan

- Thể chất, độ đồng nhất: Cho cao lên lam kính, đặt la men lên trên ép sát đem

soi dưới kính hiển vi, kiểm tra độ đồng nhất.

- Màu sắc: Lấy 1 g cao cho lên một tờ giấy trắng hoặc mặt kính đồng hồ không

màu, đặt lên tờ giấy trắng, quan sát.

- Mùi: Trên một mặt kính đồng hồ, đường kính từ 6 -8 cm, lấy 0,5 – 2,0 g cao

trải thành lớp mỏng, sau 15 phút, xác định mùi.

- Vị: Xác định bằng cảm quan.

2.2.2.2. Xác định hàm ẩm:

- Tiến hành theo Phụ lục 9.6 (PL – 203) DĐVN V [4].

Lấy khoảng 1g cao đặc sấy ở nhiệt độ 100 0C đến khối lượng không đổi (chênh lệch

giữa 2 lần cân không quá 0,5 mg), làm 3 lần với mỗi mẫu rồi tính kết quả trung bình.

2.2.2.3. Xác định pH của dung dịch cao đặc nồng độ 1% (kg/l)

- Tiến hành theo Phụ lục 6.2 – DĐVN V .

Pha thành dung dịch cao đặc 1% (kl/tt): Cân chính xác 1g cao đặc bài thuốc cho vào

cốc có mỏ, hòa tan, chuyển dần cao ở trong cốc bằng nước cất vào bình định mức

100ml, thêm nước cất đến vạch. Hiệu chuẩn máy đo pH lần lượt bằng các dung dịch

đệm chuẩn có pH = 7, pH = 10, pH = 4. Nhúng điện cực vào dung dịch cao đặc 1% và



30



đo trị số pH ở cùng điều kiện đo của các dung dịch đệm chuẩn khi hiệu chuẩn máy.

Làm 3 mẫu, lấy kết quả trung bình.

2.2.2.4. Nghiên cứu định tính một số thành phần hóa học của cao đặc bài thuốc,

dược liệu:

A. Định tính bằng phản ứng hóa học:

Định tính một số nhóm chất chính: tinh bột, flavonoid, saponin, coumarin,

polysaccharid… trong cao đặc và dược liệu bằng phản ứng hóa học với các thuốc thử

chung và thuốc thử đặc hiệu của từng nhóm [6].

B. Định tính bằng sắc kí lớp mỏng:

 Mẫu nghiên cứu:

- Cao đặc bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng

- Mẫu dược liệu chuẩn: Thục địa chuẩn, Bạch phục linh chuẩn, Đơn bì

chuẩn, Câu kỷ tử chuẩn, Cúc hoa chuẩn, Trạch tả chuẩn, Hoài sơn, Sơn thù.

- Chất chuẩn: loganin.

 Chiết mẫu

- Mẫu cắn methanol cao đặc: Cân 2g cao đặc vào bình nón, thêm 20 ml MeOH,

lắc siêu âm 30 phút, lọc qua giấy lọc được thấm MeOH. Cô dịch lọc cách thủy đến

cắn. Hòa cắn trong 2 ml MeOH, lọc qua giấy lọc làm dung dịch chấm sắc ký.

- Mẫu cắn ethylacetat cao đặc: Cân 2g cao đặc vào bình nón, thêm 10 ml ethanol

96 %, đun sơi hồi lưu 30 phút, lọc. Bốc hơi dịch lọc tới cắn, hòa tan cắn trong 20 ml

nước nóng, lọc rồi lắc 2 lần với ethyl acetat mỗi lần 10ml, gộp dịch chiết, cơ tới cắn,

hòa cắn trong 1 ml ethanol được dung dịch chấm sắc ký.

- Mẫu cắn cloroform cao đặc: Cân 2g cao đặc vào bình nón, thêm 10 ml hỗn hợp

CHCl3 – methanol (4:1), đun sôi dưới sinh hàn hồi lưu khoảng 10 phút. Để nguội, lọc,

cô dịch lọc còn 1ml được dung dịch chấm sắc ký.

- Mẫu dược liệu chuẩn: Thục địa chuẩn, Bạch phục linh chuẩn, Đơn bì chuẩn, Câu kỷ

tử chuẩn, Cúc hoa chuẩn, Trạch tả chuẩn. Cân 1 g mỗi dược liệu chuẩn, tiến hành chiết

như mẫu cắn methanol cao đặc được dịch chấm sắc ký của từng dược liệu chuẩn.

- Mẫu Sơn thù chuẩn: Cân 1 g Sơn thù chuẩn, tiến hành chiết như mẫu cắn ethyl acetat

cao đặc được dịch chấm sắc ký.

- Mẫu Hoài sơn chuẩn: Cân 1g Hoài sơn chuẩn, tiến hành chiết như mẫu cắn cloroform

cao đặc được dịch chấm sắc ký

- Chất chuẩn loganin: Hòa tan 10mg loganin chuẩn trong 10ml methanol được dung

dịch có nồng độ 1 mg/ml.

Điều kiện sắc kí chung

- Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel 60 F254, hoạt hóa ở 110oC trong 60 phút



31



- Pha động: Khảo sát trên các hệ dung môi khác nhau tùy từng dược liệu mỗi loại.

- Phun mẫu: Thiết bị Linomat 5 (Camag), tốc độ phun 150nl/s.

- Triển khai:

+ Dùng máy triển khai sắc ký tự động ADC2.

+ Kiểm soát độ ẩm: dung dịch KSCN bão hòa trong 10 phút.

+ Bão hòa bình triển khai 20 x 10 trong 20 phút (giấy lọc) bằng 25ml dung

mơi pha động.

+ Thể tích dung môi khai triển: 10 ml.

+ Khoảng cách triển khai là 85 mm kể từ đáy bản mỏng. Sấy khô bản

mỏng trong 5 phút.

Phát hiện: Soi UV ở bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc thuốc thử hiện màu đặc

trưng tùy loại dược liệu.

Chụp ảnh sắc ký đồ: Buồng chụp Camag.

Xử lý kết quả: Phần mềm Wincats, Videoscan.



 Tiến hành: Chấm các mẫu trên băng dài 6 mm, cách cạnh dưới bản mỏng

10 mm, cách cạnh bên 15 mm. Triển khai theo điều kiện chung.

2.2.2.5. Phương pháp xây dựng và thẩm định tiêu chuẩn định lượng trong cao Kỷ

cúc địa hoàng bằng HPLC

a. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng loganin trong cao đặc Kỷ cúc

địa hoàng bằng HPLC

 Khảo sát điều kiện sắc kí: [9], [11], [53], [63], [73].

 Quy trình xử lý mẫu

Tham khảo tài liệu tham khảo [53], quy trình xử lý mẫu cao được thực hiện như

sau: Cân chính xác khoảng 2g cao đặc Kỷ cúc địa hồng vào bình nón có nút

mài, thêm chính xác 50ml methanol 50%, đậy nút, cân. Chiết siêu âm trong 45

phút, để nguội, cân lại, bổ sung lượng mất đi bằng methanol 50%, lắc đều, lọc.

Hút chính xác 25 ml dịch lọc, đem cất quay tới cắn. Hòa tan cắn trong bình định

mức 10ml bằng methanol 50% được dung dịch thử.

Hàm lượng % loganin tính theo cao khơ tuyệt đối theo cơng thức:



Trong đó:

C: nồng độ mẫu thử tính theo phương trình hồi quy tuyến tính (mg/ml)

M: khối lượng mẫu cao đem phân tích (mg)

Â: độ ẩm của cao đặc.



32



 Điều kiện sắc ký

Chương trình sắc ký lỏng được khảo sát ban đầu dựa trên các điều kiện sắc ký

được tham khảo trong tài liệu [53]

 Cột Agilent Eclipse XDB-C18 (150 ì 4.6 mm; 5àm)

Detector UV, bc sóng phát hiện: 236 nm

 Tốc độ dòng: 1.0 ml/min

 Nhiệt độ cột: 400C

 Thể tích tiêm: 10 µl

Pha động gồm 3 thành phần dựa trên các điều kiện sắc ký được tham khảo trong

tài liệu [53]: methanol: acetonitrile: acid phosphoric 0.1%

- Mẫu phân tích: cao bài thuốc (được chuẩn bị theo quy trình đã được mơ tả trong

phần quy trình xử lý mẫu).

- Mẫu chuẩn: Hòa tan chất chuẩn loganin trong methanol (TT) để được dung dịch

có nồng độ chính xác khoảng 40 µg/ml

 Thẩm định phương pháp định lượng [9], [11]

Sau khi khảo sát quá trình xử lý mẫu và các điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định

phương pháp định lượng loganin bằng HPLC trong bài thuốc:

Thẩm định phương pháp phân tích theo AOAC về thẩm định quy trình phân tích gồm

các tiêu chí:

 Độ đặc hiệu:

Tiến hành sắc kí các dung dịch: mẫu trắng (dung mơi), mẫu đối chứng, mẫu chuẩn,

mẫu thử theo điều kiện đã lựa chọn.

Yêu cầu:

+ Trên sắc kí đồ của dung dịch thử, pic chính phải có thời gian lưu trùng với pic

loganin trên sắc kí đồ dung dịch chuẩn, nếu có pic phụ thì pic của chất cần phân tích

cần tách hồn tồn ra khỏi chất này.

+ Trên sắc kí đồ của mẫu trắng và mẫu đối chứng không xuất hiện pic có thời gian lưu

tương ứng với pic loganin.

 Độ phù hợp của hệ thống:

Tính tương thích của hệ thống sắc ký được xác định bằng cách phân tích dung dịch

chuẩn loganin có nồng độ thích hợp 6 lần lặp lại trong điều kiện sắc ký đã lựa chọn.



33



Ghi lại các thơng số về thời gian lưu, diện tích của pic loganin. Tính RSD (%) của thời

gian lưu và diện tích pic.



RSD % =

Trong đó:

yi là diện tích pic loganin mỗi lần tiêm mẫu

ӯ là trung bình diện tích pic loganin của các lần tiêm mẫu

n là số lần tiêm mẫu lặp lại

Yêu cầu: RSD ≤ 2%.

 Xác định khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic

- Pha một dãy dung dịch chuẩn loganin ở các nồng độ thích hợp.Tiến hành sắc ký như

điều kiện đã lựa chọn.

- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ loganin

trong các dụng dịch chuẩn.

Yêu cầu: Hệ số tương quan R ≥ 0,99

 Khảo sát độ chính xác (độ lặp lại) của phương pháp

Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác khoảng 2000 mg cao cho vào bình nón có nút mài

thêm chính xác 50 ml MeOH 50%, cân, đem chiết siêu âm trong 1 giờ, để nguội, cân

lại, bổ sung lượng MeOH 50% mất đi, lắc đều, lọc. Hút 25 ml dịch lọc cô trên cách

thủy đến cắn. Hòa tan cắn bằng 10 ml MeOH 50% vào bình định mức 10 ml. được

dịch tiêm sắc ký.

Hàm lượng % loganin tính theo cao khơ tuyệt đối theo cơng thức:



Trong đó:

C: nồng độ mẫu thử tính theo phương trình hồi quy tuyến tính (mg/ml)

M: khối lượng mẫu cao đem phân tích (mg)

Â: độ ẩm của cao đặc.



34



Tiến hành định lượng lặp lại trên 6 mẫu thử độc lập, thực hiện trên 2 ngày khác

nhau và 2 người định lượng khác nhau với cách tiến hành và điều kiện sắc ký như trên.

Tính RSD của kết quả định lượng.

Yêu cầu: RSD ≤ 2%.

 Khảo sát độ đúng của phương pháp

- Độ đúng của phương pháp được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn. Thêm

vào mẫu thử một lượng chất chuẩn loganin tương ứng với 3 mức nồng độ 20%,

50%, 80% so với nồng độ định lượng. Tại mỗi mức nồng độ thực hiện trên 3 mẫu

độc lập. Tiến hành xử lý mẫu, phân tích theo quy trình. Song song tiến hành một

mẫu chuẩn.

- Mẫu thêm chuẩn: Cân chính xác khoảng 2 g cao đặc và thêm vào lần lượt chính

xác 180 µl, 450 µl và 720 µl dung dịch chuẩn gốc loganin cho vào bình chiết rồi

tiến hành chiết như quy trình đã khảo sát.

- Mẫu nền: Cân chính xác khoảng 2 g cao đặc rồi tiến hành chiết như quy trình đã

khảo sát.

-Xác định tỷ lệ (%) tìm lại được so với nồng độ ban đầu.

Yêu cầu:

-Tỷ lệ thu hồi đạt 95,0-105,0%.

-RSD của tỷ lệ thu hồi tại mỗi mức nồng độ ≤ 2%.

b. Ứng dụng định lượng loganin trong cao đặc phương thuốc

- Sử dụng phương pháp đã xây dựng tiêu chuẩn định lượng trong cao đặc phương

thuốc Kỷ cúc địa hoàng.

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu – đánh giá kết quả

- Các số liệu thu thập được xử lý bằng phương pháp thống kê

- Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn (



  X SD ).



35



CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Bào chế cao đặc

- Bào chế cao đặc theo sơ đồ hình 2.2

- Ký hiệu: Nước – N, số lần chiết – T để mã hóa các mẫu cao.

- Tiến hành thí nghiệm để lựa chọn thơng số cho quy trình chiết, bao gồm



 Bước 1. Khảo sát nguyên liệu đầu vào

Kết quả xác định hàm ẩm nguyên liệu đầu vào được trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1. Hàm ẩm dược liệu ban đầu

STT Dược liệu

Hàm ẩm (%)

1

Thục địa

21,95

2

Hồi sơn

8,36

3

Sơn thù

6,80

4

Đơn bì

6,67

5

Bạch linh

15,79

6

Trạch tả

9,36

7

Câu kỷ tử

2,80

8

Cúc hoa

10,79

 Bước 2: Lựa chọn tỉ lệ dược liệu và dung môi nước (DL/N) (kl/v):

- Cố định thời gian chiết: Mỗi mẻ chiết 3 lần, mỗi lần đun sôi 90 phút.

- Khảo sát lựa chọn tỷ lệ DL/N lần lượt theo các tỉ lệ sau

o Tỉ lệ DL/N =1/4 - Cao N4T3

o Tỉ lệ DL/N =1/6 - Cao N6T3

o Tỉ lệ DL/N =1/8 - Cao N8T3

o Tỉ lệ DL/N =1/10 - Cao N10T3

- Tiến hành trong cùng một điều kiện chiết và điều kiện cô như nhau.

 Mỗi loại cao làm 3 mẻ, lượng dung môi được bù đủ liên tục để đảm bảo tỉ lệ

DL/N.

 Các mẫu cao được đem định lượng theo điều kiện sắc kí đã khảo sát, từ đó lựa

chọn tỉ lệ DL/N thích hợp dựa trên hàm lượng hoạt chất có trong cao thu được và các

chỉ tiêu chất lượng đã khảo sát.

 Bước 3: Lựa chọn số lần chiết xuất:

- Cố định tỉ lệ DL/N là 1/8.

- Khảo sát thời gian chiết: cố định một lần chiết là đun sôi 90 phút như bước 1,

tiến hành chiết cao bài thuốc theo số lần chiết (n) như sau:

o n = 2 – Cao N8T2.

o n = 3 – Cao N8T3.

o n = 4 – Cao N8T4.

- Tiến hành trong cùng điều kiện chiết và điều kiện cô như nhau.

 Mỗi loại cao làm 3 mẻ, lượng dung môi được bù đủ liên tục để đảm bảo tỉ lệ

DL/N.



36



 Các mẫu cao được đem định lượng theo điều kiện sắc kí đã khảo sát, từ đó lựa

chọn thời gian chiết thích hợp dựa trên hàm lượng hoạt chất có trong cao thu được và

các chỉ tiêu chất lượng đã khảo sát.

 Kết quả thu được trình bày ở Bảng 3.2

Bảng 3.2. Hàm ẩm, tỷ lệ cao chiết trong các mẫu cao đặc

Cao đặc

n Hàm ẩm (%)

tỷ lệ cao chiết (%)

Cao N4T3

3 17,23 ± 1,29

31,69 ± 0,26

Cao N6T3

3 14.93 ± 0,73

39,77 ± 0,37

Cao N8T3

3 17,12 ± 1,18

43,47 ± 0,18

Cao N10T3 3 15,98 ± 1,76

43,85 ± 0,17

Cao N8T2

3 15,71 ± 2,08

37,54 ± 0,42

Cao N8T4

3

16,8 ± 1,05

44,18 ± 0,07

3.2. Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc Kỷ cúc địa hoàng

3.2.1. Khảo sát chỉ tiêu vật lý

Quan sát, mơ tả tính chất cao đặc về cảm quan. Kết quả như sau:

- Thể chất: đặc, sánh, hơi dính tay

- Màu sắc: màu đen tuyền

- Mùi vị: mùi thơm, vị hơi chua hơi đắng.

Nhận xét: kết quả về cảm quan cao đặc Kỷ cúc địa hoàng đạt tiêu chuẩn của

DĐVN V.

3.2.2. Xác định pH

Tiến hành theo Phụ lục 6.2 – DĐVN V. Kết quả thu được ở Bảng 3.3 sau:



Bảng 3.3. Kết quả đo pH của cao đặc Kỷ cúc địa hồng

pH

Trung bình

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Mẫu thử

4,65

4,68

4,75

4,69

Nhận xét: Giá trị pH trung bình của mẫu cao đặc thu được ở trong khoảng 4.69.

Mẫu cao



3.2.4. Khảo sát chỉ tiêu định tính

3.2.4.1.



Định tính các nhóm chất trong cao bằng phản ứng hóa học:



Mẫu nghiên cứu: cao đặc, dược liệu bào chế cao (Thục địa, Sơn thù, Hoài sơn, Đơn bì,

Bạch phục linh, Trạch tả, Câu Kỷ tử, Cúc hoa).

Tiến hành định tính các nhóm chất chính trong các mẫu nghiên cứu bằng các phản ứng

hóa học thường quy. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.4:



37