1. Trang chủ >
  2. Kinh Tế - Quản Lý >
  3. Quản lý nhà nước >

4/ Ammonium persulfate (APS) 10%

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (13.04 MB, 275 trang )


- Tris 2M pH 8,8 25 ml;

- Nuớc cất 2 lần 25 ml, chỉnh pH 6,8 bằng HCl đậm đặc;

- SDS 10% 4 mL, định mức 100ml với nuớc cất 2 lần.

7/ Dung dịch đệm 2X SDS

- Tris 2M (pH 8,8) 6,25 ml;

- Nuớc cất 2 lần 30 ml, chỉnh pH 6,8 bằng HCl đậm đặc;

- SDS: 4g;

- Glycerol: 20 ml;

- ß- mercaptoethanol: 10 ml;

- Bromophenol blue: 0,2 g;

Ðịnh mức với nuớc cất 2 lần tới 100 ml, Bảo quản ở -200C.

8/ Đệm 10X Electrophresis (pH 8,3)

- Tris base: 30 g;

- Glycine: 144 g;

- SDS: 10 g;

- Nuớc cất 2 lần: 1000 ml, chỉnh pH 8,3 bằng HCl đậm đặc.

9/ Gel staining

- Coomassie brilliant blue R250: 2,5 g

- Methanol: 450 ml

- Glacial acid acetic: 100 ml;

- Nuớc cất 2 lần: 450 ml

10/ Gel destaining

- Methanol: 300 ml;

- Glacial acetic acid: 100 ml;

- Nuớc cất 2 lần: 600 ml.

1.3.2. Chuẩn bị mẫu

- Mẫu gelatin (1g) được hòa tan trong 10 ml dung dịch SDS 10% (w /v). Hỗn

hợp được gia nhiệt ở 950C trong 1 giờ;

- Mẫu được ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng,



lấy phần dịch trong;

- Dịch trong được trộn với dung dịch đệm 2X SDS theo tỉ lệ 1:1 (v/v).

1.3.3. Chạy điện di

1/ Ðổ gel

- Lau sạch các tấm kính bằng ethanol, sau dó lau lại thật sạch bằng nuớc cất,

gắn các tấm kính vào giá đỡ và kiểm tra độ kín;

- Cho dung dịch separating gel vào giữa 2 tấm kính đã chuẩn bị sẵn lên đến

hơn 3/4 chiều cao tấm kính;

- Cho tiếp dung dịch stacking gel vào giữa 2 tấm kính, bên trên separating

gel cho hết chiều cao tấm kính và để cho gel đơng;

- Cho gel vào buồng điện di, đổ ngập gel bằng dung dịch đệm 10X

Electrophoresis buffer. Chú ý khơng để bọt khí ở phía duới tấm kính, dùng pipet

làm sạch gel thừa trong các giếng.

2/ Chạy điện di

- Chạy không tải (prerun) khoảng 5 phút ở điện thế 80÷100 V;

- Dùng Hamilton syringe để load mẫu vào các giếng, cẩn thận để mẫu không

bị tràn ra ngoài;

- Sau khi mẫu được load mẫu vào gel, chạy điện di ở điện thế 60÷100 V

trong khoảng từ 2,5 - 4,5 giờ cho dến khi vạch màu di hết chiều dài tấm kính.

3/ Nhuộm và rửa gel

- Lấy gel ra khỏi buồng diện di, cho vào hộp nhựa chứa dung dịch gel

staining, lắc nhẹ khoảng 25 vòng/phút trong khoảng từ 10÷15 phút;

- Rửa gel bằng dung dịch gel destaining trên máy lắc nhẹ, khoảng 10÷15

phút cho đến khi gel sáng màu.



1.4. Phương pháp xác định tổng hàm lượng nitơ bazơ bay hơi (TVB-N)

theo TCVN 9215:2012

1.4.1. Nguyên tắc

Nitơ bazơ bay hơi (TVB-N) từ mẫu được chiết bằng dung dịch acid



perchloric. Sau khi kiềm hóa, dịch chiết được chưng cất và toàn bộ chất bay hơi sẽ

được hấp thụ bằng bình chứa acid boric. Hàm lượng TVB-N được xác định thông

qua việc chuẩn độ các bazơ được hấp thụ bằng dung dịch acid clohydric chuẩn.



1.4.2. Cách tiến hành

1.4.2.1. Chuẩn bị mẫu

Lấy 10 g ± 0,1 g mẫu thử đã được nghiền mịn, thêm 90,0 ml dung dịch acid

percloric, đồng hóa mẫu trong 2 phút bằng máy trộn, lọc trong bằng giấy lọc và

định mức 100 ml bằng nước cất.



1.4.2.2. Chưng cất mẫu

- Cho 50 ml dịch chiết thu được vào thiết bị chưng cất Kjeldahl. Đầu ra của

thiết bị chưng cất phải ngập trong 100 ml dung dịch acid boric đã được bổ sung

khoảng 5 giọt dung dịch chỉ thị hỗn hợp Tashiro.

- Để kiểm tra độ kiềm hóa của dịch chiết, thêm vài giọt phenolphthalein, bổ

sung vài giọt chất chống tạo bọt silicon, 6,5 ml dung dịch NaOH 5N vào dịch chiết

và tiến hành chưng cất trong thời gian 7÷10 phút.



1.4.2.3. Chuẩn độ

Các bazơ bay hơi có trong dịch cất được chuẩn độ bằng dung dịch acid

clohydric chuẩn (0,01N). Kết thúc chuẩn độ khi dịch cất chuyển từ màu xanh lá cây

sang màu tím bền. (pH của dung dịch ngay sau khi kết thúc chuẩn độ khoảng 5,0 ± 0,1)

- Tiến hành song song với mẫu trắng nhưng sử dụng 50,0 ml dung dịch acid

percloric thay cho dịch chiết mẫu.



1.4.2.4. Tính kết quả

Tổng hàm lượng nitơ bazơ bay hơi (X) trong mẫu được tính bằng mg/100 g

mẫu theo cơng thức sau:

X =



Trong đó:



(V1 − V0 ) × a V2

×

× 100

m

V3



V1: thể tích dung dịch chuẩn acid clohydric đã dùng để chuẩn độ mẫu, (ml);



V0 : thể tích dung dịch chuẩn acid clohydric đã dùng để chuẩn độ mẫu trắng,

(ml);

a: số mg nitơ tương ứng với một ml dung dịch chuẩn acid clohydric (0,14

mg/ml):

m: khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

V2: thể tích dịch lọc sau khi định mức (ml) ( V2 = 100 ml);

V3: thể tích dịch lọc được lấy để chưng cất (ml) (V3 = 50 ml).



1.5. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số theo phương pháp FolinCiocalteu

1.5.1. Nguyên tắc

Polyphenol tổng số trong mẫu được xác định bằng đo màu dùng thuốc thử

Folin-Ciocalteu. Thuốc thử này chứa acid phospho-vonframi là chất oxy hóa. Trong

q trình khử, các nhóm hydroxyl phenol dễ bị oxy hóa, chất oxy hóa này sinh ra

màu xanh có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 765nm. Phản ứng này là do sự hình

thành màu xanh của vonfarm và molypden. Dùng acid gallic làm chất chuẩn để tính

được hàm lượng polyphenol tổng số trong mẫu.



1.5.2. Cách tiến hành

Cho 2 g mẫu hòa vào dung môi ethanol 72,5% với tỉ lệ 1:20. Dịch chiết thu

được hòa lỗng ở nồng độ thích hợp, sau đó 1ml dịch chiết đã pha lỗng trộn với

5ml thuốc thử Folin-Ciocalteu rồi để n từ 3÷8 phút. Sau đó thêm 4ml Na2CO3,

đậy nắp, lắc và để yêu ở nhiệt độ phòng 60 phút trước khi đo độ hấp thụ ở bước

sóng 765nm.

Hàm lượng polyphenol tổng số được tính theo phần trăm khối lượng chất

khơ theo cơng thức sau:



Trong đó:



𝑊𝑊 =



𝑚𝑚𝑔𝑔 ∗𝑉𝑉∗𝑑𝑑∗10−6

𝑚𝑚𝑐𝑐𝑐𝑐



∗ 100%



W: hàm lượng polyphenol tổng số (%)

mg: khối lượng polyphenol theo phương trình đường chuẩn (µg/ml)



V: thể tích dịch chiết (ml)

d: độ pha lỗng

mck: khối lượng chất khơ của nguyên liệu (g)

* Đường chuẩn acid galic

Đường chuẩn của acid galic

Mật độ quang



0.6

0.5



y = 0.0102x - 0.0024

R² = 0.9999



0.4

0.3

0.2

0.1

0

0



10

20

30

40

50

Hàm lượng acid galic khan (µg/ml)



60



1.6. Xác định hàm lượng anthocyanin

1.6.1. Nguyên lý

Dựa trên sự đổi màu và thay đổi độ hấp thụ của anthocyanin theo sự thay đổi

của pH. Tại pH 1,0 các anthocyanin ở dạng muối oxinium (còn gọi là cation

flavylium) có màu và có độ hấp thụ cực đại. Ở pH 4,5 anthocyanin có dạng carbinol

khơng màu nên độ hấp thụ gần như bằng không.



1.6.2. Tiến hành

Lấy 0,5 g bột màu anthocyanin, chiết nhiều lần trong cồn 80%. Lấy 5 ml dịch

chiết định mức bằng dung dịch đệm pH 1,0 và pH 4,5 đến 25 ml. Đo mật độ quang

của mẫu pH 1,0 và pH 4,5 tại bước sóng hấp thụ cực đại (520 nm) và tại bước sóng

700 nm (hiệu chỉnh độ mù) bằng máy quang phổ kế UV-Vis CARY 60.



1.6.3. Tính kết quả

Hàm lượng màu anthocyanin được tính theo cơng thức



M=



A x M W x D F x V x103

ε xl



Trong đó:

- M là hàm lượng màu anthocyanin (tương đương cyanidin-3-glucoside, mg);

- A là độ hấp thụ của mẫu đã pha loãng;



A = (Aλmax – A700)pH 1.0 – (Aλmax – A700)pH 4.5

Aλmax: mật độ quang của mẫu đo tại bước sóng hấp thụ cực đại (520 nm);

A700: mật độ quang của mẫu đo tại bước sóng 700nm.

- MW: khối lượng phân tử của anthocyanin, tính theo cyanidin-3-glucoside

(449,2g/mol);

- l: chiều dày của cuvet, cm;

- DF: độ pha lỗng;

- V: thể tích màu thu được của mẫu, lít;

- ε : hệ số hấp thụ phân tử (26.900 lít x mol-1 x cm-1)

- 103 hệ số chuyển đổi từ g sang mg.



1.7. Xác định hàm lượng đường khử

1.7.1. Nguyên tắc: Đường khử có khả năng khử ion Cu2+ trong dung dịch fehling

tạo thành Cu2O kết tủa màu đỏ gạch. Cu2O phản ứng với dung dịch Fe2(SO4)3 trong

môi trường H2SO4 đậm đặc tạo FeSO4, dùng KMnO4 0,1N chuẩn để chuẩn độ

FeSO4 ở môi trường acid. Thời điểm kết thúc định phân, dung dịch có màu hồng

bền trong 30 giây. Từ số ml KMnO4 0,1N tiêu tốn, tra bảng có được số mg đường

glucose, nhân với hệ số pha loãng sẽ tính được hàm lượng đường khử có trong mẫu.



1.7.2. Cách tiến hành

Cân chính xác 5 g mẫu kẹo cho vào cốc thủy tinh. Hòa tan mẫu hồn tồn

bằng nước cất, chuyển sang bình định mức 100ml, tráng cốc bằng nước cất cho vào

bình định mức trên, cho nước cất đến vạch định mức.

Thêm 1,5 g bột chì acetate, lắc đều và lọc qua giấy lọc. Hứng dung dịch lọc

vào cốc khơ sạch ta thu được dung dịch mẫu.

Cho vào bình nón 250ml: 10ml dung dịch mẫu, 10ml fehling A, 10ml fehling

B, lắc nhẹ. Đặt bình nón lên trên bếp điện, đun sơi trong 3 phút. Lấy bình nón ra để

nghiêng cho kết tủa lắng xuống. ( Chú ý: Dung dịch bên trên lớp kết tủa Cu2O phải

còn màu xanh của Cu2+. Nếu mất màu xanh nghĩa là không đủ lượng Cu2+ cần thiết

để phản ứng).

Khi kết tủa Cu2O lắng xuống, gạn phần nước bên trên và lọc qua phễu lọc

bằng máy hút chân không. Rửa kết tủa bằng nước đã đun sôi và gạn lọc tiếp tục vào

phễu cho đến khi trong bình nón mất màu xanh. Trong q trình gạn lọc, không để



kết tủa Cu2O lọt vào phễu và ln giữ có một lớp nước trên mặt Cu2O.

Lần cuối cùng gạn hết nước và cho ngay 10ml Fe2(SO4)3 để hòa tan Cu2O

trong bình nón. Lọc dung dịch Fe2(SO4)3 đã hòa tan Cu2O bằng phễu lọc.

Tráng bình nón và rửa bằng Fe2(SO4)3 cho đến khi khơng còn vết Cu2O trong

bình nón và phễu. Tráng phễu bằng nước cất đun sơi rồi đổ vào phễu và hút hết

xuống bình lọc. Chuẩn độ FeSO4 có trong mẫu bằng dung dịch KMnO4 0,1N cho

đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây.



1.7.3. Tính kết quả

Hàm lượng đường khử tính có trong mẫu được tính theo cơng thức:

Rs =



a.Vo .100

1000.V .G



(%)



Trong đó:

a: lượng đường glucose tìm được ở bảng tra theo thể tích KMnO4 tiêu

tốn (mg)

Vo: thể tích bình định mức (ml)

V: thể tích dung dịch thử lấy từ bình định mức (ml)

G: khối lượng mẫu (g)

100: hệ số để tính hàm lượng đường khử trong 100g sản phẩm

1000: hệ số chuyển đổi từ mg thành g của a



1.8. Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí theo TCVN 4884-1:2015 (ISO

4833-1:2013)

1.8.1. Mơi trường, hóa chất

- Dung dịch Saline Peptone Water.

- Plate count agar (PCA).



1.8.2. Tiến hành

- Cấy mẫu:

+ Lấy 2 đĩa petri vô trùng. Hút vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử (độ pha lỗng 10-1).



+ Lấy 2 đĩa petri vơ trùng khác. Hút vào mỗi đĩa 1 ml dịch pha loãng 10-2 .

+ Lặp lại trình tự này với các dịch pha lỗng tiếp theo.

+ Nếu thích hợp và nếu có thể, chỉ chọn các bước pha lỗng tới hạn (ít nhất 2

dung dịch pha loãng thập phân liên tiếp) để cấy các đĩa petri sao cho thu được số

đếm từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc trên mỗi đĩa petri.

+ Rót vào mỗi đĩa pettri khoảng 12÷15ml mơi trường thạch đếm đĩa (PCA) đã

được làm nguội ở 44oC đến 47oC.

+ Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường bằng cách xoay đĩa petri và để cho

hỗn hợp đông đặc lại bằng cách đặt các đĩa petri trên bề mặt nằm ngang, mát.

- Nuôi ủ: Lật ngược các đĩa đã cấy mẫu và ủ trong 72 giờ ± 3 giờ ở 30oC ±

1oC.



1.8.3. Tính kết quả

Tính số vi sinh vật có mặt trong mẫu thử N, lấy trung bình từ hai độ pha lỗng

kế tiếp nhau bằng cơng thức sau:

N=



∑C



V [n1 + (0.1n 2)]d



∑C: tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại từ 2 độ pha

lỗng liên tiếp, ít nhất có một đĩa chứa 15 khuẩn lạc.

V: thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa tính bằng ml

n1: số đĩa của độ pha lỗng thứ nhất được giữ lại

n2: số đĩa của độ pha loãng thứ hai được giữ lại

d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại (d=1 khi

sản phẩm dạng lỏng khơng pha lỗng).



1.9. Xác định E. Coli theo TCVN 7924-2:2008

1.9.1. Mơi trường, hóa chất



- Dung dịch Saline peptone water

- Môi trường thạch Trytone - bile - glucuronic (TBX)



1.9.2. Tiến hành

- Cấy mẫu:

+ Dùng pipet vô trùng cấy vào hai đĩa petri vô trùng mỗi đĩa 1 ml mẫu thử.

Lặp lại trình tự này đối với độ pha loãng 10-2 và các độ pha loãng thập phân tiếp

theo.

+ Đổ vào mỗi đĩa Petri đã cấy khoảng 15ml thạch TBX đã được đun tan và

làm nguội ở 44÷470C trong bể điều nhiệt. Lắc đều để đống nhất môi trường và mẫu,

để môi trường đông đặc trên mặt phẳng ngang.

- Ủ mẫu:

Sau khi mơi trường đơng đặc hồn toàn, lật ngược đĩa và ủ trong tủ ấm 440C

+ 1.00C trong khoảng 18÷24 giờ. Tổng thời gian ni cấy không vượt quá 24 giờ.

- Đọc kết quả:

Sau khi kết thúc giai đoạn ủ, đếm tất cả các khuẩn lạc có màu xanh.



1.9.3. Tính kết quả

Tính số lượng E. coli β- glucuronidase dương tính trong 1g hoặc 1ml mẫu như

sau:



N=



∑a



V (n1 + 0,1n2 )d



(13)



Trong đó:

∑a: là tổng số khuẩn lạc xanh đếm được trên các đĩa, trong đó có ít nhất 1

đĩa chứa ít nhất 15 khuẩn lạc xanh.

V : thể tích dịch mẫu cấy trên mỗi đĩa (ml).

n1: số đĩa đếm được ở nồng độ thứ nhất.

n2: số đĩa đếm được ở nồng độ thứ hai.

d: nồng độ tương ứng với độ pha loãng thứ nhất đếm được.



1.10. Xác định Staphylococcus aureus theo TCVN 4830-1:2005

1.10.1. Mơi trường, hóa chất

- Dung dịch Saline Peptone water

- Thạch Baird Parker (BP)

- Triptic soy agar (TSA)

- Coagulase plasma



1.10.2. Tiến hành

- Cấy mẫu:

+ Cấy trang 0,1ml dịch mẫu đã pha lỗng thích hợp bằng que cấy trang tam

giác đã được thanh trùng lên bề mặt của các đĩa môi trường chọn lọc Baird Parker.

+ Nếu số lượng coagulase positive staphylococci thấp thì giới hạn phát hiện

có thể nâng hệ số lên 10 bằng cách nuôi cấy 1ml dịch mẫu kiểm tra lên trên bề mặt

3 đĩa thạch.

- Nuôi ủ:

Lật ngược các đĩa và ủ ở 37 ± 1OC trong 24 ± 3 giờ và 48 ± 4 giờ.

- Đọc kết quả:

+ Đọc kết quả sau 24±3 giờ trên môi trường Baird Paker Agar ghi nhận những

khuẩn lạc điển hình và khơng điển hình (nếu có). Đọc lại sau 48+4 giờ ni cấy, ghi

nhận các khuẩn lạc mới điển hình và khơng điển hình.

(Khuẩn lạc điển hình là những khuẩn lạc có màu đen hoặc xám, sáng và lồi.

Đường kính là 1,0÷1,5mm sau 24 giờ ni cấy, và đường kính là 1,5÷2,5mm sau 48

giờ ni cấy. Mỗi khuẩn lạc điển hình được bao quanh bởi một vùng sáng. Sau ni

cấy ít nhất 24 giờ, một vòng sáng đục sát khuẩn lạc có thể xuất hiện trong vùng

sáng này. Khuẩn lạc khơng điển hình khơng có vùng sáng và mờ, có thể có viền

sáng hẹp)

- Khẳng định:

+ Chọn 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc khơng điển hình từ mơi trường

BP cấy sang mơi trường không chọn lọc (TSA). Nuôi ở 37± 1OC trong 24 giờ.

+ Thực hiện các test:



* Gram và Catalase

* Coagulase

* Thực hiện cấy chuyển khoảng 5 khuẩn lạc đã được làm thuần trên TSA từ

mỗi lứa cấy sang môi trường Coagulase, các khuẩn lạc đã được làm tan trong 2÷3

giọt môi trường BHI. Nuôi ở 37± 1OC. Kiểm tra sự hình thành khối đơng trong 6

giờ bằng cách thử nghiêng ống nghiệm. Nếu kết quả là âm tính thì kiểm tra lại sau

24 giờ nuôi cấy.

+ Đọc kết quả test coagulase:

* Dương tính: nếu khối đơng hình thành hồn tồn hay hơn ½ thể tích.

* Âm tính: Khơng hình thành khối đông, vẫn giữ nguyên dạng lỏng (giống

như dịch mẫu chưa ủ).



1.10.3. Tính kết quả

Số lượng Staphylococcus aureus trên 1g (ml) mẫu (CFU/g(ml)):

Cs = (F1 x Nt x Ht) + (F2 x Na x Ha)

Trong đó:

Cs: Số lượng vi sinh vật tính trên đơn vị tính (CFU/g);

F : Nồng độ pha lỗng của mẫu;

Nt: Tổng số khuẩn lạc điển hình trên các đĩa;

Na: Tổng số khuẩn lạc khơng điển hình trên các đĩa;

Ht: Số khuẩn lạc điển hình thử nghiệm cho kết quả dương tính/ Số khuẩn lạc

điển hình được thử nghiệm;

Ha: Số khuẩn lạc khơng điển hình thử nghiệm cho kết quả dương tính/ Số

khuẩn lạc khơng điển hình được thử nghiệm.



1.11. Pha dung dịch đệm pH 1 và pH 4,5

Đệm pH 1: hòa 1,86g KCl vào 980ml nước cất, dùng HCl đậm đặc để điều

chỉnh đến pH 1. Chuyển tồn bộ dung dịch vào bình định mức 1 lit và thêm nước

cất đến vạch định mức.

Đệm pH 4,5: hòa 54,43g CH3COONa.3H2O vào 960ml nước cất, dùng HCl

đậm đặc để điều chỉnh đến pH=4,5. Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 1

lit và thêm nước cất đến vạch định mức.



Xem Thêm
Tải bản đầy đủ (.pdf) (275 trang)

×