Hình11: Ức chế enzyme topoisonmerase I và II

Luận văn Thạc sĩ 2013

não, protein này là dạng thụ  thể  màng tế  bào đột biến, có tên gọi là EGFRvIII,  

liên quan đến sự tăng trưởng của ung thư.

Các nhà khoa học thuộc Trường Đại học Gorgia Mỹ  vừa nghiên cứu một  

loại vaccin mang tên Herceptin khả năng phòng ngừa tổng hợp lên tới khoảng 7 

loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao như hiện nay: ung thư tiền liệt tuyến, ung thư 

tụy, ung thư đường ruột và ung thư buồng trứng…Vaccin này có chứa một lượng 

nhỏ các protein có tên là MUC1, có tác dụng luyện tập cho hệ miễn dịch cơ thể,  

từ đó hệ miễn dịch có thể nhận biết sự xuất hiện của tế bào ung thư và hệ miễn  

dịch có thể chủ động tấn cơng [38].

Cevac  là một loại vắc­xin chống lại bệnh ung thư đại tràng, là một kháng  

thể  đơn dòng gây ra  một phản  ứng miễn dịch với CEA   (Carcino Embryonic  

Antigen). Kháng ngun CEA này hiện diện trong ung thư ruột.

Mặt khác, việc điều trị kết hợp các loại vaccin với thuốc hóa trị  liệu làm 

tăng tỷ lệ sống sót: Herceptin thường gắn liền với taxol và ceavac được dùng cho 

bệnh nhân kết hợp với fluorouracil­5 và leucovorin.

Đề  kháng với các chất chống ung thư  là một trong những thách thức lớn  

của hóa trị  liệu. Sự  đề  kháng này được gây ra bởi nhiều yếu tố và cơ  chế  vẫn 

chưa được hiểu rõ. Yếu tố có thể là do:

­ Gây ra từ sự sửa chữa ADN giống như polymerase­β.

­ Giảm sự  xâm nhập của thuốc vào trong tế  bào (làm giảm nồng độ  của thuốc  

trong các tế bào).

­ Sự gia tăng từ trong ra ngồi của các khối u tế bào đa kháng .

­ Hấp thụ thuốc trong tế bào ngăn, ngăn cản tiếp xúc của thuốc với tế bào mang  

bệnh. 

­ Sự biến đổi hoặc thay đổi enzyme đích.

Điều trị  ung thư  bằng vaccin cũng có nhiều tác dụng phụ  và đơi khi còn  

gây chết người. Với những thách thức này, việc tìm kiếm các loại thuốc mới  



19



Luận văn Thạc sĩ 2013

chống ung thư là cần thiết và các phân tử   từ  tự  nhiên ln là nguồn tài ngun  

q giá.

1.3.3 Ứng dụng của các hợp chất tự nhiênt trong điều trị ung thư

Hiện nay, ung thư vẫn là bài tốn khó đối với y học và là căn bệnh đáng sợ nhất

   của con người do chưa có thuốc đặc trị. Vì thế, các nhà khoa học vẫn khơng  

ngừng

kiếm tìm các hợp chất mới để  tiêu diệt căn bệnh của thời đại, nhất là khi các  

phương pháp điều trị  hiện nay như  hóa trị, xạ  trị, phẫu thuật...đều để  lại tác  

dụng xấu, nhiều bệnh nhân Ung thư chết do suy kiệt trước khi chết vì ung thư

Trong hành trình đó, các nhà nghiên cứu đã tách chiết các hợp chất hóa học 

và trên cơ sở đã bán tổng hợp và tổng hợp ra rất nhiều hợp chất có khả năng ức 

chế sự phát triển và diệt tế bào ung thư như

Các nhà nghiên cứu tại Viện nghiên cứu Y khoa Sanford­Burnham, đứng 

đầu là Kristiina Vuori, MD, Ph.D., đã phát hiện ra một hợp chất tự nhiên là 

sceptrin được tìm thấy trong các lồi bọt biển, làm giảm sự di chuyển của các tế 

bào ung thư và có độc tính rất thấp.

Những nghiên cứu lâm sàng bước đầu đã chỉ ra rằng Curcumin có tác dụng 

tốt với một số bệnh ung thư như: ung thư tuyến tụy, ung thư vú, ung thư da, ung 

thư trực tràng…

Một nghiên cứu của Đại học Missouri, Mỹ cho thấy, resveratrol­một hợp 

chất được tìm thấy trong quả nho và rượu vang đỏ có thể khiến một số tế bào 

ung thư như nhạy cảm hơn với xạ trị.

 



Ngày nay, các nhà khoa học vẫn đang miệt mài nghiên cứu nhằm tìm được 



những hợp chất có hoạt tính cao trong điều trị ung thư

1.4 Các phương pháp nghiên cứu độ độc tế bào



20



Luận văn Thạc sĩ 2013

Một vài phép so màu nhanh đã được miêu tả  trong thử  nghiệm trên các dòng tế 

bào ung thư   ở  mức độ  in vitro, trong đó hiện nay người ta thường sử  dụng hai 

phương pháp là: phương pháp MTT và phương pháp SRB.

1.4.1 Phương pháp MTT

Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử  dụng phổ 

biến. Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí 

Immunological Methods năm 1983 [1]. Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng 

để  triển khai phép thử  so màu, qua đó đánh giá về  sự  sống sót và khả  năng phát 

triển của tế  bào động vật. Ngun lý của phép thử  là vòng tetrazolium bám chặt 

vào ti thể  của tế  bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu 

vàng của MTT biến  đổi thành màu tím formazan. Kết quả  đọc trên máy quang 

phổ  và có  độ  chính xác cao. Phương pháp  được dùng  để  đo  độ  độc của chất 

nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào.

1.4.2 Phương pháp SRB

Phép thử  SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự  năm 1990 để  đánh  

giá độc tính của chất nghiên cứu và khả  năng phát triển của tế  bào trong  ứng 

dụng sàng lọc thuốc  ở qui mơ lớn. Ngun tắc của phép thử  là khả  năng nhuộm 

màu của SRB lên protein¸ SRB nhuộm bằng cách phá vỡ  màng tế  bào, những 

mảnh vỡ  tế  bào khơng bị  nhuộm, do đó khơng  ảnh hưởng đến số  liệu thực 

nghiệm. Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc 

vào pH của các dư  lượng amino acid của các protein. Dưới các điều kiện mơi  

trường axit nhẹ, SRB liên kết với các dư  lượng amino acid trên các protein của  

các tế bào đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu 

như  Tris­base để  hòa tan và đo mật độ  quang của dịch chiết từ tế bào một cách 

định lượng.

1.5 Phân loại các hợp chất thứ cấp trong thực vật



21



Luận văn Thạc sĩ 2013

Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ 

gia thực phẩm có giá trị. Nhữn sản phẩm này được biết như  là các chất trao đổi 

thứ cấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng  

trao đổi chất chưa được viết đầy đủ. Chúng dường như  là sản phẩm của các 

phản ứng hóa học của thực vật với mơi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống 

lại vi sinh vật và động vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn 

gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20. Các chất trao đổi  

thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm  chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside.

Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý  

trên tất cả động vật và được sử  dụng trong cơng nghiệp dược. Họ  alkaloid bao  

gồm: codein, caffeine và morphine. Một số lồi thực vật chứa nhiều alkaloid như:  

cây thuốc phiện (họ  Papaveraceate; cây canh kin a (họ  Rubiaceae); cây cà độc  

dược, thuốc lá và khoai tây. Người ta thường gặp trong một cây tập hợp alkaloid 

có cấu trúc hóa học gần giống nhau. Đơi khi tồn cây chứa alkaloid, đơi khi chỉ 

tập trung trong lá. Các alkaloid có hoạt tính sinh học rất khác biệt, một số  tác  

dụng lên hệ thần kinh (caffeine, atropine, strychnine…), một số tác dụng lên các 

cơ  (veratrin, atropine…), một số  tác dụng lên mạch máu, một số  khác tác dụng  

lên bộ  máy hơ hấp. Alkaloid thường  độc với liều lượng lớn nhưng với liều  

lượng nhỏ, chúng được sử dụng làm thuốc chữa bệnh.

Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và 

dung   môi.   Giống   như   những   lipid   khác,   các   terpenoid   không   tan   trong   nước.  

Terpên được xây dựng từ những đơn vị  5 carbon và được thiết lập từ nhiều đơn  

vị isoprene, ví dụ monoterpene chứa 2 đơn vị isoprene.

Các   glycoside  bao   gồm   các   hợp   chất   phenol   và   flavonoid,   saponin   và   các 

cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử  dụng làm thuốc nhuộm, chất  

mùi thực phẩm và dược phẩm.



22



Luận văn Thạc sĩ 2013



CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Cây Cơm (E. griffithii) được thu hái vào ngày 5 tháng 2 năm 2004 tại Qùy  

Châu, Nghệ  An và được ThS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên – Viện 

Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam) định tên. Mẫu tiêu bản số VN 1249  

được lưu trữ tại Viện Sinh thái Tài ngun và Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học 

và Cơng nghệ Việt Nam.

Vỏ cây tươi sau khi sấy khơ, xay nhỏ thu được 1,4 kg ngun liệu.

2.1.2. Các dạng tế bào 

Các dạng tế  bào ung thư   ở  người được cung cấp bởi ATCC gồm:  KB 

(Human epidermic carcinoma) – ung thư biểu mơ, là dòng ln ln được sử dụng 

trong các phép thử độ độc tế bào; và MCF­7 (Human breast carcinoma) – ung thư 

vú.

2.1.3 Thiết bị và hóa chất tách chiết mẫu thực vật

Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhơm tráng sẵn silicagel 

60 F254 Merk, độ dày 0,2mm.

Sắc ký cột tổng sử dụng silica gel cỡ hạt 63­ 100 mm

Sắc ký cột thường sử dụng silica gel cỡ hạt 40 m  ­ 63  m  

Các loại cột sắc ký với kích cỡ khác nhau.

Bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254, 365nm sau 

đó



23



Luận văn Thạc sĩ 2013

hiện màu bằng thuốc thử Ce(SO4); thuốc thử vanilin­H2SO4 (vanillin 1,2g; MeOH 

200ml, CH3COOH 25ml; H2SO4 11ml)

Điểm nóng chảy đo trên máy BUCHI Melting Point B545 (Thụy Sĩ) của 

viện

Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Brucker Avance 

500MHz viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

Các dung mơi như n­hexan, etyl axetat, diclometan, metanol, aceton, etanol

 đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng.

2.1.4 Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính gây độc tế bào

Mơi trường ni cấy tế  bào: AMEM và AMEM có bổ  sung 1% insulin,  

trypsin­EDTA (Gibco, Hoa kỳ)

Dung mơi để hòa tan chất cần thử hoạt tính: DMSO

Tủ   ấm CO2  (Innova CO­170); Tủ  cấy vơ trùng cấp I ( Labcaire), cấp II  

(SterilGard II); 

Máy li tâm (universal 320 R); Kính hiển vi ngược (Axiovert 40 CFL)

Tủ lạnh sâu ­25oC, ­ 800C

 



Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ)



 



Máy quang phổ (GENios Tecan)

Bình nit ơ  l ỏ ng b ả o qu ả n t ế  bào và các d ụ ng c ụ  thí nghi ệ m thơng  



th ườ ng khác.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp hóa học

2.2.1.1 Phương pháp chiết dịch etylaxetat tổng

Dựa vào ngun lý chiết và tài liệu tham khảo  chúng tơi thực hiện ngâm 

chiết với dung mơi có độ  phân cực tăng dần. Thực hiện ngâm chiết   mẫu lần 



24