Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (10.86 MB, 90 trang )
Luận văn Thạc sĩ 2013
hiện màu bằng thuốc thử Ce(SO4); thuốc thử vanilinH2SO4 (vanillin 1,2g; MeOH
200ml, CH3COOH 25ml; H2SO4 11ml)
Điểm nóng chảy đo trên máy BUCHI Melting Point B545 (Thụy Sĩ) của
viện
Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Brucker Avance
500MHz viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
Các dung mơi như nhexan, etyl axetat, diclometan, metanol, aceton, etanol
đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng.
2.1.4 Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính gây độc tế bào
Mơi trường ni cấy tế bào: AMEM và AMEM có bổ sung 1% insulin,
trypsinEDTA (Gibco, Hoa kỳ)
Dung mơi để hòa tan chất cần thử hoạt tính: DMSO
Tủ ấm CO2 (Innova CO170); Tủ cấy vơ trùng cấp I ( Labcaire), cấp II
(SterilGard II);
Máy li tâm (universal 320 R); Kính hiển vi ngược (Axiovert 40 CFL)
Tủ lạnh sâu 25oC, 800C
Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ)
Máy quang phổ (GENios Tecan)
Bình nit ơ l ỏ ng b ả o qu ả n t ế bào và các d ụ ng c ụ thí nghi ệ m thơng
th ườ ng khác.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Các phương pháp hóa học
2.2.1.1 Phương pháp chiết dịch etylaxetat tổng
Dựa vào ngun lý chiết và tài liệu tham khảo chúng tơi thực hiện ngâm
chiết với dung mơi có độ phân cực tăng dần. Thực hiện ngâm chiết mẫu lần
24
Luận văn Thạc sĩ 2013
lượt với các dung mơi etylaxetat và MeOH ở nhiệt độ thường. Mỗi loại dung mơi
tiến hành ngâm chiết 3 lần, mỗi lần trong vòng 24h.
2.2.1.2. Sắc ký cột (Colum chromatography CC)
Sắc ký cột là phương pháp thường được sử dụng để phân tách các chất
dựa vào độ phân cực của chúng hoặc tùy theo kích thước phân tử. Trong
nghiên cứu này, việc phân lập các chất được thực hiện bằng sắc ký cột với
chất mang là silica gel (hệ dung mơi rửa giải với độ phân cực tăng dần) hoặc
gel LH20.
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel Merck loại 40
63 m với dung mơi rửa giải thích hợp.
2.2.1.3 Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer Chromatography – TLC)
S¾c ký lớp mỏng là phương pháp nghiên cứu hiệu quả để phân tích và xác
định số lượng các nhóm chất khác nhau có trong thành phần dịch chiết thực vật
hoặc các phân đoạn tách ra từ đó. Dựa trên ngun tắc các chất khác nhau có độ
dịch chuyển khác nhau nên tách ra ở vị trí khác nhau. Đây là phương pháp vi
lượng, hiệu quả tách cao và thời gian thực hiện ngắn.
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel Merck 60 F254,
dày 0,25 mm. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng (λ = 254 nm và
λ = 366 nm ) và dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2.
Đối với sắc ký bản mỏng, việc lựa chọn dung mơi hay hệ dung mơi cho
độ phân tách tốt là quan trọng nhất. Cụ thể với các u cầu khảo sát thì chọn hệ
dung mơi sao cho các vệt phân tách nhau tốt nhất.
2.2.1.4 Phổ khối lượng (Mass spectrometry MS)
Khối phổ là một trong các phương pháp được sử dụng để xác định khối
lượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát triển ra ion phân tử, từ đó
giúp xây dựng cơng thức phân tử.
25
Luận văn Thạc sĩ 2013
Phổ khối lượng phun mù điện tử ( Electron Spray Ionization Mass Spectra)
được đo bằng phương pháp ESI trên máy Agilent 1120 tại Viện Hóa học, Viện
Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.2.1.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (Nuclear
magnetic resonance spectrometry NMR)
Phổ NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các
hợp chất hóa học, dựa trên ngun tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các
ngun tử khi được đặt trong một từ trường. Trong phổ NMR có hai thơng số có
đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa
học δ và hằng số tương tác spin – spin J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và
2D NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM 500 FT
NMR Spectrometer, Viện Hóa học Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt
Nam
với TMS là chất chuẩn nội.
2.2.2 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa
kỳ
(NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các
chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in
vitro.
Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được ni cấy trong các mơi trường
ni cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh bê (FBS) và các thành phần
cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO 2, 37 oC, độ ẩm 98%, vơ trùng tuyệt
đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy
chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử
hoạt độc tính. Mẫu thơ có IC50 50 g/ml; chất sạch có IC50 30 g/ml được
26
Luận văn Thạc sĩ 2013
đánh giá là có hoạt tính gây độc tế bào, có khả năng ức chế sự phát triển hoặc
diệt tế bào ung thư.
Thử độc tế bào:
Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 g/ml; 32 g/ml; 8 g/ml;
2 g/ml; 0,5 g/ml. Bổ xung 200 l dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế
bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng. Giếng điều khiển có 200 l dung dịch tế bào
3x104 tế bào/ml. Ủ ở 370C/ 5% CO2 trong 72h.
Sau 72h thêm 50 l MTT (1mg/ml pha trong mơi trường ni cấy khơng huyết
thanh) và ủ tiếp ở 370C/4 giờ; loại bỏ mơi trường, thêm 100 l DMSO lắc đều
đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.
GI: Phần trăm kìm hãm sự phát triển
Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển
của
tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.
Thí nghiệm được lặp lại với n = 3
2.3 Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Cơm
2.3.1 Thành phần hóa học
2.3.1.1 Phân lập cặn chiết etylaxetat
Vỏ cây được thu hái, phơi khơ trong bóng mát, sấy khơ ở 4050oC cho đến
khi độ ẩm đạt ≤ 13% và nghiền nhỏ cân được 1,44 kg. Ngun liệu này được
ngâm chiết lần lượt với etylaxetat (3 lần, mỗi lần 24 giờ), sau đó là MeOH (3
lần, mỗi lần
24 giờ), thu được các dịch chiết tương ứng là etylaxetat và MeOH. Các dịch
chiết này được cất loại dung mơi dưới áp suất thấp, kết quả thu được 52g cặn
chiết etylaxetat và 172,8 g cặn chiết MeOH. Trong khn khổ luận văn chúng tơi
chỉ tập trung nghiên cứu phần cặn chiết EtOAC. Quy trình tách chiết dịch
etylaxetat được trình bày theo sơ đồ sau:
27
Luận văn Thạc sĩ 2013
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tách chiết dịch etylaxetat từ vỏ cây Cơm
2.3.1.2 Phân lập các chất có trong cặn chiết etylaxetat
Cặn chiết etylaxetat được phân tách bằng sắc ký cột trên cột silica gel, hệ
dung mơi rửa giải là CH2Cl2/MeOH với tỷ lệ MeOH tăng dần từ 0 30 %, thu
được 5 phân đoạn được ký hiệu từ E1 – E5. Phân đoạn E1 được phân tách trên
cột silica gel với hệ dung mơi nhexan/CH2Cl2 gradient với tỷ lệ CH2Cl2 tăng dần
từ 50 70% thu được 24 phân đoạn ký hiệu là E1.1E1.24. Phân đoạn E1.7 được
tinh chế trên cột silica gel với hệ dung mơi nhexan/CH2Cl2 gradient với tỷ lệ
CH2Cl2 tăng dần từ 2 40% thu được 2 phân đoạn ký hiệu là E1.7.1 và E1.7.2.
Phân đoạn E1.7.1 tiếp tục được tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi n
hexan/CH2Cl2 gradient (95:5) và giải hấp cột với hệ dung môi CH2Cl2 / MeOH
gradient cho hợp chất F1 (12 mg). Phân đoạn E1.12 được kết tinh lại trong hệ n
Hexan:diclometan (3:7) thu được 103 mg tinh thể hình kim, màu trắng. Hợp chất
này được nhận dạng là βsitosterol dựa vào việc so sánh điểm nóng chảy và sắc
ký lớp mỏng (TLC) với hợp chất βsitosterol chuẩn có sẵn trong phòng thí
nghiệm.
Phân đoạn E2 xuất hiện chất rắn màu trắng, chất rắn được lọc và rửa lại
nhiều lần với hệ CH2Cl2/MeOH, thu được 45 mg hợp chất F2. Ngồi ra, dịch lọc
được quay khơ rồi tinh chế trên cột silica gel với dung mơi rửa giải là CH 2Cl2 /
MeOH gradient thu được 30 mg chất bột màu trắng. Hợp chất này được nhận
dạng là βsitosterol glucoside dựa vào việc so sánh nóng chảy và sắc ký lớp
mỏng (TLC) với hợp chất βsitosterol glucoside chuẩn có sẵn trong phòng thí
nghiệm.
Phân đoạn E5 được phân tách trên cột silica gel với hệ dung mơi CH2Cl2/
MeOH/HCOOH (80:15:5) gradient thu được 11 phân đoạn ký hiệu là E5.1E5.11.
Tinh thể của phân đoạn E5.4 được tinh chế trên cột sephadex LH 20 cho hợp
28
Luận văn Thạc sĩ 2013
chất F3 (7 mg). Tinh thể của phân đoạn E5.9 tiếp tục được tinh chế lại trên cột
sephadex LH20 thu được hợp chất F4 (5 mg).
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất của dịch EtoAc từ vỏ cây Cơm
2.3.2 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập được từ dịch
chiết etylaxetat
Các chất đã tinh sạch được tiến hành thử hoạt tính theo các phương pháp
đã nêu trong phần 2.2.2
Cân 3mg chất cần thử, hòa tan bằng DMSO (150μl) có giếng chất nồng độ
đầu là 20mg/ml. Tiến hành pha lỗng tiếp theo tỉ lệ ¼ để được các nồng độ chất
thử
tiếp theo. Chất sau khi hòa tan trong DMSO được pha lỗng về các nồng độ thấp
hơn bằng nước cất cho các nồng độ lần lượt là 2,56 mg/ml; 0,64 mg/ml;0,16
mg/ml;
0,04 mg/ml; 0,01 mg/ml. Sử dụng 10 μl chất thử đã pha lỗng cho mỗi giếng thử
nghiệm để được các nồng độ 128 g/ml; 32 g/ml; 8 g/ml; 2 g/ml; 0,5 g/ml.
Tiến hành thử theo các phương pháp đã nêu.
29
Luận văn Thạc sĩ 2013
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong khn khổ dự án Pháp – Việt về “Nghiên cứu hóa thực vật thảm
thực vật Việt Nam”, cây Cơm đã được thử sơ bộ hoạt tính sinh học. Kết quả cho
thấy dịch chiết etylaxetat của vỏ cây Cơm thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên
dòng tế bào KB (ức chế 89,45 % ở nồng độ 1 µg/ml). Chính vì vậy vỏ cây Cơm
được tiến hành tách chiết và phân lập các chất theo các phương pháp đã trình bày
ở mục 2.3.1.1 và mục 2.3.1.2
3.1 Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ dịch chiết
etylaxetat
Từ cặn chiết EtoAc chúng tơi tiến hành phân lập các hoạt chất theo sơ đồ
2.2. Kết quả thu được 4 chất sạch kí hiệu là F1F4. Các chất này được xác định
cấu trúc hóa học bằng cách kết hợp các phương pháp phổ và so sánh số liệu phổ
của chúng với các dữ liệu phổ đã được cơng bố.
3.1.1 Chất F1 (pentacosyl ferulate)
Trên phổ EIMS của F1 cho thấy sự xuất hiện của pic ion phân tử [M]+ tại
m/z 544. Trên phổ 1HNMR thấy xuất hiện tín hiệu của nhóm methyl ở trường
cao δH 0,88 (t, J = 7 Hz, CH325’) và một nhóm methoxy (OCH3) ở δH 3,915. Ở
vùng trường thấp thấy xuất hiện tín hiệu của 3 proton đặc trưng cho vòng thơm
bị thế hệ ABX, ở δH 6,86 (d, J = 8 Hz, H5), 7,05 (dd, J = 2 Hz và 8 Hz, H6) và
7,08 (d, J = 2 Hz, H2). Ngồi ra còn có tín hiệu của 2 proton alken có cấu hình
trans (E) ở δH 6,39 (d, J = 16 Hz, H8) và 7,61 (d, J = 16 Hz, H7). Ngồi ra còn có
30
Luận văn Thạc sĩ 2013
tín hiệu của 24 nhóm methylen, trong đó nhóm methylen có tín hiệu proton ở δH
4,10 (t, J = 6,5 Hz, CH21’) cho thấy nhóm này liên kết với dị tố oxy.
Trên phổ 13C NMR và DEPT của F1, ngồi các tín hiệu tương ứng với các
nhóm đã được quan sát trên phổ 1H NMR, còn xuất hiện tín hiệu của nhóm
cacbonyl cacboxylate tại δC 167,8 và 3 cacbon thơm bão hòa ở δC 126,1, 147,4 và
148,5. Các cacbon ở δC 147,4 và 148,5 cho th ấy chúng đượ c liên kết với
ngun tử oxy.
Kết hợp pic ion phân tử trên phổ khối lượng với các tín hiệu 1D NMR,
cơng thức phân tử của chất F1 đượ c xác định là C 35H60O4. Phân tich phổ 2D
NMR cho thấy sự có mặt của 2 mảng cấu trúc của hợp chất F1: A) axit
ferulic, B) pentacosan1ol. Vi ệc k ết n ối gi ữa 2 ph ần c ấu trúc này đượ c thực
hiện nhờ phân tích phổ HMBC. Trong đó tươ ng tác giữa cacbon cacboxylate ở
với proton của nhóm CH21’ ở đượ c quan sát thấy trên phổ HMBC của F1.
Điều này cho thấy hợp chất F1 là ester của axit ferulic và pentacosan1ol. Như
vậy hợp chất F1 đượ c xác định là pentacosyl ferulate. H ợp ch ất này đã đượ c
phân lập trước đây từ lồi Bauhainia manca.
Hình 13: Cấu trúc hóa học của hợp chất F1
Bảng 3.1: Số liệu phổ 1HNMR (500 MHz) và 13CNMR (125 MHz) của chất
F1 trong DMSO
Cno
δC
1
2
3
4
5
126,1
109,92
147,4
148,5
114,9
31
δ H m
(J, đơn vị Hz)
7,08 d (2,0)
6,863 d (8,0)
Cno
δC
7
8
9
1’
2’24’
144,96
114,4
167,8
64,37
28,32
δ H m
(J, đơn vị Hz)
7,61 d (16)
6,39 d (16)
4,10 t (6,5)
1,71 s (7,0; 7,5)