2 Phương pháp nghiên cứu

Luận văn Thạc sĩ 2013

lượt với các dung mơi etylaxetat và MeOH ở nhiệt độ thường. Mỗi loại dung mơi 

tiến hành ngâm chiết 3 lần, mỗi lần trong vòng 24h.

2.2.1.2. Sắc ký cột (Colum chromatography ­  CC)



Sắc ký cột là phương pháp thường được sử dụng để phân tách các chất 

dựa vào độ  phân cực của chúng hoặc tùy theo kích thước phân tử. Trong  

nghiên cứu này, việc phân lập các chất được thực hiện bằng sắc ký cột với  

chất mang là silica gel (hệ dung mơi rửa giải với độ phân cực tăng dần) hoặc  

gel LH­20.

 Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel Merck loại 40 ­  

63 m  với dung mơi rửa giải thích hợp.

2.2.1.3 Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer Chromatography – TLC)

S¾c ký lớp mỏng là phương pháp nghiên cứu hiệu quả để phân tích và xác 

định số lượng các nhóm chất khác nhau có trong thành phần dịch chiết thực vật 

hoặc các phân đoạn tách ra từ đó. Dựa trên ngun tắc các chất khác nhau có độ 

dịch chuyển khác nhau nên tách ra  ở  vị  trí khác nhau. Đây là phương pháp vi  

lượng, hiệu quả tách cao và thời gian thực hiện ngắn.

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel Merck 60 F254, 

dày 0,25 mm. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng (λ =  254 nm và 

λ = 366 nm ) và dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2.

Đối với sắc ký bản mỏng, việc lựa chọn dung mơi hay hệ  dung mơi cho 

độ phân tách tốt là quan trọng nhất. Cụ thể với các u cầu khảo sát thì chọn hệ 

dung mơi sao cho các vệt phân tách nhau tốt nhất.

2.2.1.4 Phổ khối lượng (Mass spectrometry ­ MS)

Khối phổ  là một trong các phương pháp được sử  dụng để  xác định khối  

lượng phân tử  của chất nghiên cứu dựa vào sự  phát triển ra ion phân tử, từ  đó 

giúp xây dựng cơng thức phân tử.



25



Luận văn Thạc sĩ 2013

Phổ khối lượng phun mù điện tử ( Electron Spray Ionization Mass Spectra)  

được đo bằng phương pháp ESI trên máy Agilent 1120 tại Viện Hóa học, Viện  

Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

2.2.1.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (Nuclear 

magnetic resonance spectrometry ­ NMR)

Phổ  NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các  

hợp chất hóa học, dựa trên ngun tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các 

ngun tử khi được đặt trong một từ trường. Trong phổ NMR có hai thơng số có 

đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa 

học δ và hằng số tương tác spin – spin  J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và  

2D NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo.

Phổ  cộng hưởng từ  hạt nhân được đo trên máy Bruker AM 500 FT­

NMR Spectrometer, Viện Hóa học ­ Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt 

Nam

với TMS là chất chuẩn nội.

2.2.2 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa  

kỳ

 (NCI) xác nhận là phép thử  độ  độc tế  bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các 

chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in 

vitro.

Các dòng tế  bào ung thư  nghiên cứu được ni cấy trong các mơi trường 

ni cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh bê (FBS) và các thành phần  

cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO 2, 37 oC, độ ẩm 98%, vơ trùng tuyệt 

đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế  bào khác nhau, thời gian cấy 

chuyển cũng khác nhau. Tế  bào phát triển  ở  pha log sẽ  được sử  dụng để  thử 

hoạt độc tính. Mẫu thơ có IC50   50  g/ml; chất sạch có IC50   30  g/ml  được 



26



Luận văn Thạc sĩ 2013

đánh giá là có hoạt tính gây độc tế  bào, có khả  năng  ức chế  sự  phát triển hoặc  

diệt tế bào ung thư.

Thử độc tế bào:

­ Mẫu thử   được pha loãng theo dãy nồng  độ  là 128   g/ml; 32 g/ml; 8 g/ml; 

2 g/ml; 0,5 g/ml. Bổ  xung 200 l dung dịch tế bào ở  pha log nồng độ  3 x 104 tế 

bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng. Giếng điều khiển có 200  l dung dịch tế bào 

3x104 tế bào/ml. Ủ ở 370C/ 5% CO2 trong 72h.

­ Sau 72h thêm 50  l MTT (1mg/ml pha trong mơi trường ni cấy khơng huyết 

thanh) và  ủ  tiếp  ở  370C/4 giờ; loại bỏ  mơi trường, thêm 100  l DMSO lắc đều 

đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.

GI: Phần trăm kìm hãm sự phát triển

Giá trị  IC50 được tính dựa trên kết quả  số liệu phần trăm kìm hãm sự  phát triển  

của 

tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.

Thí nghiệm được lặp lại với n = 3

2.3 Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Cơm 

2.3.1 Thành phần hóa học

2.3.1.1 Phân lập cặn chiết etylaxetat

Vỏ  cây được thu hái, phơi khơ trong bóng mát, sấy khơ  ở  40­50oC cho đến 

khi độ   ẩm đạt  ≤ 13% và nghiền nhỏ  cân được 1,44 kg. Ngun liệu này được  

ngâm chiết lần lượt với etylaxetat (3 lần, mỗi lần 24 giờ), sau đó là MeOH (3  

lần, mỗi lần

 24 giờ), thu được các dịch chiết tương ứng là etylaxetat và MeOH. Các dịch 

chiết này được cất loại dung mơi dưới áp suất thấp, kết quả  thu được 52g cặn 

chiết etylaxetat và 172,8 g cặn chiết MeOH. Trong khn khổ luận văn chúng tơi 

chỉ   tập   trung   nghiên   cứu   phần   cặn   chiết   EtOAC.   Quy   trình   tách   chiết   dịch 

etylaxetat được trình bày theo sơ đồ sau:



27



Luận văn Thạc sĩ 2013



Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tách chiết dịch etylaxetat từ vỏ cây Cơm

2.3.1.2 Phân lập các chất có trong cặn chiết etylaxetat

Cặn chiết etylaxetat được phân tách bằng sắc ký cột trên cột silica gel, hệ 

dung mơi rửa giải là CH2Cl2/MeOH với tỷ  lệ  MeOH tăng dần từ  0 ­ 30 %, thu 

được 5 phân đoạn được ký hiệu từ  E1 – E5. Phân đoạn E1 được phân tách trên 

cột silica gel với hệ dung mơi n­hexan/CH2Cl2 gradient với  tỷ lệ CH2Cl2  tăng dần 

từ  50­ 70% thu được 24 phân đoạn ký hiệu là E1.1­E1.24. Phân đoạn E1.7 được  

tinh chế  trên cột silica gel với hệ  dung môi n­hexan/CH2Cl2   gradient với   tỷ  lệ 

CH2Cl2    tăng dần từ  2­ 40% thu được 2 phân đoạn ký hiệu là E1.7.1 và E1.7.2. 

Phân đoạn E1.7.1 tiếp tục được tinh chế  trên cột silica gel với hệ  dung môi n­

hexan/CH2Cl2  gradient (95:5) và giải hấp cột với hệ  dung mơi CH2Cl2  / MeOH 

gradient cho hợp chất F1 (12 mg). Phân đoạn E1.12 được kết tinh lại trong hệ n­

Hexan:diclometan (3:7) thu được 103 mg tinh thể hình kim, màu trắng. Hợp chất  

này được nhận dạng là β­sitosterol dựa vào việc so sánh điểm nóng chảy và sắc 

ký   lớp   mỏng   (TLC)   với   hợp   chất  β­sitosterol   chuẩn   có   sẵn   trong   phòng   thí 

nghiệm. 

Phân đoạn E2 xuất hiện chất rắn màu trắng, chất rắn được lọc và rửa lại 

nhiều lần với hệ CH2Cl2/MeOH, thu được 45 mg hợp chất  F2. Ngồi ra, dịch lọc 

được quay khơ rồi tinh chế  trên cột silica gel với dung mơi rửa giải là CH 2Cl2 / 

MeOH gradient thu được 30 mg chất bột màu trắng. Hợp chất này được nhận  

dạng là  β­sitosterol glucoside  dựa vào việc so sánh nóng chảy và sắc ký lớp  

mỏng (TLC) với hợp chất  β­sitosterol glucoside chuẩn có sẵn trong phòng thí 

nghiệm.

Phân đoạn E5 được phân tách trên cột silica gel với hệ dung mơi CH2Cl2/ 

MeOH/HCOOH (80:15:5) gradient thu được 11 phân đoạn ký hiệu là E5.1­E5.11. 

Tinh thể  của   phân đoạn E5.4 được tinh chế  trên cột sephadex LH 20 cho hợp  



28