3 Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Côm

Luận văn Thạc sĩ 2013



Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tách chiết dịch etylaxetat từ vỏ cây Cơm

2.3.1.2 Phân lập các chất có trong cặn chiết etylaxetat

Cặn chiết etylaxetat được phân tách bằng sắc ký cột trên cột silica gel, hệ 

dung mơi rửa giải là CH2Cl2/MeOH với tỷ  lệ  MeOH tăng dần từ  0 ­ 30 %, thu 

được 5 phân đoạn được ký hiệu từ  E1 – E5. Phân đoạn E1 được phân tách trên 

cột silica gel với hệ dung mơi n­hexan/CH2Cl2 gradient với  tỷ lệ CH2Cl2  tăng dần 

từ  50­ 70% thu được 24 phân đoạn ký hiệu là E1.1­E1.24. Phân đoạn E1.7 được  

tinh chế  trên cột silica gel với hệ  dung mơi n­hexan/CH2Cl2   gradient với   tỷ  lệ 

CH2Cl2    tăng dần từ  2­ 40% thu được 2 phân đoạn ký hiệu là E1.7.1 và E1.7.2. 

Phân đoạn E1.7.1 tiếp tục được tinh chế  trên cột silica gel với hệ  dung mơi n­

hexan/CH2Cl2  gradient (95:5) và giải hấp cột với hệ  dung mơi CH2Cl2  / MeOH 

gradient cho hợp chất F1 (12 mg). Phân đoạn E1.12 được kết tinh lại trong hệ n­

Hexan:diclometan (3:7) thu được 103 mg tinh thể hình kim, màu trắng. Hợp chất  

này được nhận dạng là β­sitosterol dựa vào việc so sánh điểm nóng chảy và sắc 

ký   lớp   mỏng   (TLC)   với   hợp   chất  β­sitosterol   chuẩn   có   sẵn   trong   phòng   thí 

nghiệm. 

Phân đoạn E2 xuất hiện chất rắn màu trắng, chất rắn được lọc và rửa lại 

nhiều lần với hệ CH2Cl2/MeOH, thu được 45 mg hợp chất  F2. Ngồi ra, dịch lọc 

được quay khơ rồi tinh chế  trên cột silica gel với dung mơi rửa giải là CH 2Cl2 / 

MeOH gradient thu được 30 mg chất bột màu trắng. Hợp chất này được nhận  

dạng là  β­sitosterol glucoside  dựa vào việc so sánh nóng chảy và sắc ký lớp  

mỏng (TLC) với hợp chất  β­sitosterol glucoside chuẩn có sẵn trong phòng thí 

nghiệm.

Phân đoạn E5 được phân tách trên cột silica gel với hệ dung mơi CH2Cl2/ 

MeOH/HCOOH (80:15:5) gradient thu được 11 phân đoạn ký hiệu là E5.1­E5.11. 

Tinh thể  của   phân đoạn E5.4 được tinh chế  trên cột sephadex LH 20 cho hợp  



28



Luận văn Thạc sĩ 2013

chất F3 (7 mg). Tinh thể của phân đoạn E5.9 tiếp tục được tinh chế lại trên cột 

sephadex LH­20 thu được hợp chất F4 (5 mg).

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất của dịch EtoAc từ vỏ cây Cơm

2.3.2  Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập được từ dịch 

chiết etylaxetat

Các chất đã tinh sạch được tiến hành thử  hoạt tính theo các phương pháp 

đã nêu trong phần 2.2.2

Cân 3mg chất cần thử, hòa tan bằng DMSO (150μl) có giếng chất nồng độ

đầu là 20mg/ml. Tiến hành pha lỗng tiếp theo tỉ lệ ¼ để được các nồng độ chất 

thử

tiếp theo. Chất sau khi hòa tan trong DMSO được pha lỗng về các nồng độ thấp 

hơn bằng nước cất cho các nồng  độ  lần lượt là 2,56 mg/ml; 0,64 mg/ml;0,16 

mg/ml;

0,04 mg/ml; 0,01 mg/ml. Sử dụng 10 μl chất thử đã pha lỗng cho mỗi giếng thử

nghiệm để được các nồng độ 128  g/ml; 32 g/ml; 8 g/ml; 2 g/ml; 0,5 g/ml.

Tiến hành thử theo các phương pháp đã nêu.



29



Luận văn Thạc sĩ 2013



CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Trong khn khổ  dự  án Pháp – Việt về  “Nghiên cứu hóa thực vật thảm  

thực vật Việt Nam”, cây Cơm đã được thử sơ bộ hoạt tính sinh học. Kết quả cho  

thấy dịch chiết etylaxetat của vỏ cây Cơm thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên  

dòng tế bào KB (ức chế  89,45 %  ở nồng độ 1 µg/ml). Chính vì vậy vỏ cây Cơm 

được tiến hành tách chiết và phân lập các chất theo các phương pháp đã trình bày  

ở mục 2.3.1.1 và mục 2.3.1.2

3.1 Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ dịch chiết 

etylaxetat

Từ cặn chiết EtoAc chúng tơi tiến hành phân lập các hoạt chất theo sơ đồ 

2.2. Kết quả thu được 4 chất sạch kí hiệu là F1­F4. Các chất này được xác định 

cấu trúc hóa học bằng cách kết hợp các phương pháp phổ và so sánh số liệu phổ 

của chúng với các dữ liệu phổ đã được cơng bố.

3.1.1 Chất F1 (pentacosyl ferulate)

Trên phổ EI­MS của F1 cho thấy sự xuất hiện của pic ion phân tử [M]+ tại 

m/z 544. Trên phổ  1H­NMR thấy xuất hiện tín hiệu của nhóm methyl  ở  trường 

cao δH  0,88 (t,  J = 7 Hz, CH3­25’) và một nhóm methoxy (OCH3)  ở  δH 3,915. Ở 

vùng trường thấp thấy xuất hiện tín hiệu của 3 proton đặc trưng cho vòng thơm  

bị thế hệ ABX,  ở  δH 6,86 (d, J = 8 Hz, H­5), 7,05 (dd, J = 2 Hz và 8 Hz, H­6) và 

7,08 (d, J = 2 Hz, H­2). Ngồi ra còn có tín hiệu của 2 proton alken có cấu hình  

trans (E) ở δH 6,39 (d, J = 16 Hz, H­8) và 7,61 (d, J = 16 Hz, H­7). Ngồi ra còn có 



30



Luận văn Thạc sĩ 2013

tín hiệu của 24 nhóm methylen, trong đó nhóm methylen có tín hiệu proton  ở   δH 

4,10 (t, J = 6,5 Hz, CH2­1’) cho thấy nhóm này liên kết với dị tố oxy.

Trên phổ  13C NMR và DEPT của F1, ngồi các tín hiệu tương ứng với các 

nhóm đã  được  quan sát trên phổ  1H NMR, còn xuất hiện tín hiệu của  nhóm 

cacbonyl cacboxylate tại δC 167,8 và 3 cacbon thơm bão hòa  ở   δC 126,1, 147,4 và 

148,5.   Các   cacbon   ở   δC  147,4   và   148,5   cho   th ấy   chúng   đượ c   liên   kết   với  

ngun tử oxy.

Kết hợp pic ion phân tử trên phổ khối lượng với các tín hiệu 1D NMR,

cơng thức phân tử  của chất F1 đượ c xác định là C 35H60O4. Phân tich phổ  2D 

NMR   cho   thấy   sự   có   mặt   của   2   mảng   cấu   trúc   của   hợp   chất   F1:   A)   axit  

ferulic, B)  pentacosan­1­ol. Vi ệc k ết n ối gi ữa 2 ph ần c ấu trúc này đượ c thực 

hiện nhờ  phân tích phổ  HMBC. Trong đó tươ ng tác giữa cacbon cacboxylate  ở 

với proton của nhóm CH2­1’  ở  đượ c quan sát thấy trên phổ  HMBC của F1.  

Điều này cho thấy hợp chất F1 là ester của axit ferulic và pentacosan­1­ol. Như 

vậy hợp chất F1 đượ c xác định là pentacosyl ferulate.  H ợp ch ất này đã đượ c 

phân lập trước đây từ lồi Bauhainia manca.



Hình 13: Cấu trúc hóa học của hợp chất F1

Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H­NMR (500 MHz) và 13C­NMR (125 MHz) của chất 

F1 trong DMSO

Cno



δC



1

2

3

4

5



126,1

109,92

147,4

148,5

114,9



31



δ H m 

(J, đơn vị Hz)

7,08 d (2,0)



6,863 d (8,0)



Cno



δC



7

8

9

1’

2’­24’



144,96

114,4

167,8

64,37

28,32



δ H m 

(J, đơn vị Hz)

7,61 d (16)

6,39 d (16)

4,10 t (6,5)

1,71 s (7,0; 7,5)