Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

2.2. Nguyên vật liệu và đối tượng nghiên cứu

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu

Cao ethanol chiết từ toàn cây Cải cần (Corydalis balansae Prain.)

2.2.1.1. Nguồn gốc

Cải cần được thu hái tại Cao Bằng (tháng 4/2018). Dược liệu được PGS.TS.

Phạm Thị Thanh Huyền (Trưởng khoa Tài nguyên dược liệu – Viện Dược liệu)

giám định mẫu và lưu mẫu tại Viện Dược liệu. Dược liệu thu hái được phơi khơ,

sau đó được nghiền thành bột thô để chiết thu cao ethanol tổng phục vụ cho

nghiên cứu.

2.2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Điều chế cao chiết được thực hiện bởi Khoa Hóa Phân tích, Viện Dược liệu.

Quy trình chiết cao ethanol cải cần được mơ tả tóm tắt như sau (Hình 2.1): Dược

liệu cải cần được thu hái đem phơi khô. Dược liệu được ngâm trong dung mơi

ethanol 90%. Sau đó chiết dược liệu hai lần với ethanol 70%, mỗi lần chiết trong

3 giờ. Dịch chiết thu được đem lọc và thu hồi dung môi. Cô đến khi khối lượng

không đổi với hiệu suất 22,4%, và hàm ẩm 11,65%. Mẫu cao chiết này được hòa

tan trong nước để cho chuột uống trong suốt quá trình nghiên cứu.



24



22,4 g cao khơ,

hàm ẩm 11,65 %

Hình 2.1: Sơ đồ chiết cao toàn phần Cải cần bằng ethanol

Cao thu được a (g) chiếm tỷ lệ 22,4 % so với dược liệu khô với hàm ẩm là

11,65% được gọi là cao cải cần (CC). Phương pháp định lượng được ghi trong

phụ lục 1 và 2.

2.2.2. Động vật thí nghiệm

Động vật được sử dụng trong nghiên cứu là chuột nhắt trắng chủng Swiss,

giới đực, trọng lượng trung bình 18 - 20 g được cung cấp bởi Viện vệ sinh dịch

tễ Trung ương. Chuột được chăm sóc và ni trong phòng thí nghiệm với nhiệt

độ duy trì 22 ± 1°C, ăn uống đầy đủ, chu kỳ sáng tối là 12/12 h (chu kỳ sáng từ

7:00 - 19:00). Chuột được nuôi ổn định 5 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm.



25



2.2.3. Hố chất và trang thiết bị

 Hóa chất

- Imipramin (Sigma - Aldrich, USA) được hòa tan bằng nước muối sinh lý để

sử dụng theo đường tiêm phúc mạc (i.p.), liều sử dụng là 8 mg/kg.

- DPPH (1,1-Diphenyl – 2-picrylhydrazyl), Methanol, DMSO.

- Tris–HCl, Nitroblue tetrazolium (NBT), NADH, Phenazine methosulfate

(PMS).



- Taq polymerase, dNTP, Reverse Transcriptase M-MuLV, DTT, oligo dT

(random hexamer), ARNase Inhibitor, RT buffer.

- NaCl 0,9%

 Trang thiết bị

- Dụng cụ pha chế và chăm sóc chuột: chày, cối sứ, kim đầu tù, kim tiêm, găng

tay, cồn, acid picric, cồn, cốc có mỏ, ống falcon, nước cất.

- Ống PCR, pippet man, đầu côn các loại, khay đựng ống.

- Hệ thống phân tích hành vi ANY-Maze (Stoelting Co., Wood Dale, IL)

- Máy Realtime-PCR, máy RT-PCR.

- Máy ELISA

- Cân phân tích, cân kỹ thuật

- Mơ hình mê lộ chữ thập nâng cao (EPM): Dụng cụ thí nghiệm được cấu tạo

gồm 2 tay kín kích thước 30 x 5 x 15 cm (dài x rộng x cao), hai tay mở kích

thước 30 x 5 x 0,25 cm vng góc với nhau, trung tâm kích thước 5 x 5 cm.

Cường độ chiếu sáng 9-11 lux.

- Mơ hình treo đi (TST): hộp có kích thước Cao 55 cm x Rộng 60 cm x Sâu

11,5 cm và được chia làm 3 ngăn. Thanh sắt tròn được vắt ngang trên đỉnh

hộp có kích thước Ø 1 cm x dài 60 cm. Có màn chắn giữa các chuột.



26



- Mơ hình bơi cưỡng bức (FST): bể chứa bằng thuỷ tinh (cao 20 cm x Ø 10 cm)

chứa nước có độ cao 10 cm, giữ ở nhiệt độ 25 oC. Có màn chắn giữa các bể

thủy tinh.



2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Nghiên cứu tác dụng giải lo âu cao chiết ethanol từ cải cần

2.3.1.1. Trên mơ hình chuột cơ lập

• Phương pháp tiến hành

Mơ hình chuột cơ lập được áp dụng theo phương pháp đang được tiến hành

tại phòng thí nghiệm Dược lý, Đại học Toyama, Nhật Bản, do GS Kinzo

Matsumoto nghiên cứu [27]. Chia chuột ngẫu nhiên thành 5 lô (mỗi lô 10-12

con) như sau:

Lô 1:



Chứng sinh lý (chuột bầy đàn), uống nước



Lô 2:



Chứng bệnh lý (chuột cô lập), uống nước.



Lô 3 - 4:



Chuột cô lập, uống mẫu nghiên cứu với 2 mức liều là

1,12 g/kg và 2,24 g/kg.



Lô 5:



Chuột cô lập, uống Imipramin liều 8 mg/ kg.



Gây stress cho chuột bằng phương pháp cơ lập trong 5 tuần, sau đó cho

chuột uống mẫu nghiên cứu hoặc nước (nhóm chứng), hoặc uống đối chứng

dương (Imipramin) trong 2 tuần liên tiếp. Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 2

lần, lấy kết quả trung bình và xử lý số liệu.



5 tuần



Ngày 0



Ngày 35



- Ăn uống đầy đủ

- Cải cần 1,12 hoặc 2,24 g/kg,

p.o

- Imipramine 8 mg/kg, i.p



49

Chuột

nuôi cô

lập



Tiến hành thử

mẫu nghiên

cứu



Thử nghiệm

EPM



Tách lấy não

và thu máu



54

Thử nghiệm

TST



Hình 2.2: Tiến trình thực hiện thí nghiệm [22, 27]



27



Ngày 60



Thử nghiệm

FST



2.3.1.2. Thử nghiệm mê lộ chữ thập nâng cao

(Elevated plus-maze - EPM)

Mơ hình chữ thập nâng cao theo mô tả của Lister RG [24]. Mê lộ chữ thập

được sử dụng để kiểm tra hành vi sợ hãi, lo âu trong các mơ hình bệnh lý rối

loạn hành vi, tâm thần trên chuột. Mê lộ chữ thập gồm hai khoang hở (open arm)

và hai khoang kín (close arm) kết nối với nhau thành hình chữ thập thơng qua

vùng trung tâm. Mê lộ được để cao cách sàn 50 cm nên có vai trò tác động như

một bài test sự sợ hãi. Do vậy, chuột có xu hướng lựa chọn khoang kín nhiều

hơn khoang hở.

- Phương pháp tiến hành:

Chuột được đặt nhẹ nhàng vào vùng trung tâm, mặt hướng về cánh tay hở, sau

đó được tự do di chuyển khám phá trong 5 phút. Chuột được coi là ở trong 1

cánh tay khi cả 4 chân đều nằm trong cánh tay đó. Q trình này được người

làm thí nghiệm theo dõi thơng qua camera, sau đó ghi lại thời gian chuột ở trong

khoang mở, khoang kín. Thí nghiệm được đánh giá độc lập bởi 2 người nghiên

cứu đảm bảo tránh sai số. Sau khi tiến hành thí nghiệm với mỗi chuột, dụng cụ

thí nghiệm được lau sạch bằng EtOH 70% trước khi tiến hành với chuột tiếp

theo để tránh lưu giữ mùi. Bài tập được thực hiện 1 lần duy nhất. Mỗi chuột

được thử trong 5 phút. Chỉ tiêu đánh giá: thời gian lưu lại ở các cánh tay mở và

kín của chuột.



28



Hình 2.3: Mơ hình mê lơ chữ thập EPM

2.3.1.3.



Thử nghiệm treo đuôi chuột (Tail suspension test - TST)



Phương pháp tiến hành:

Thử nghiệm treo đuôi được mô tả bởi Steru và cộng sự [38]. Chuột được

tiến hành trong hộp có kích thước Cao 55 cm x Rộng 60 cm x Sâu 11,5 cm và

được chia làm 3 ngăn. Thanh sắt tròn được vắt ngang trên đỉnh hộp có kích

thước Ø 1 cm x dài 60 cm. Chuột tham gia thí nghiệm được kẹp đi vào thanh

sắt treo lơ lửng trong hộp cách mặt sàn 20-25 cm. Ghi lại hành vi của chuột

được treo trên thanh sắt trong 6 phút. Sau 6 phút chuột được đưa trở về chuồng

và hộp treo chuột được lau kỹ bằng Ethanol 70% để sẵn sàng tiến hành cho các

chuột tiếp theo. Thông số đánh giá là thời gian chuột bất động (được xác định là

chuột bng tự nhiên khơng có bất kỳ một chuyển động nào ngồi hoạt động hơ

hấp).



29



Hình 2.4: Mơ hình treo đuôi chuột TST

2.3.1.4.



Thử nghiệm bơi cưỡng bức (Force Swimming Test - FST)



Thử nghiệm bơi cưỡng bức (Forced swimming test) trên chuột nhắt được mô

tả trước đây bởi R. D. Porsolt và cộng sự, đánh giá hành vi tuyệt vọng trên chuột

[31]. Chuột thí nghiệm được để trong bể chứa bằng thuỷ tinh (cao 20 cm x Ø 10

cm) chứa nước có độ cao 10 cm, giữ ở nhiệt độ 25 oC. Chuột được thả bơi tự do

trong bể. Chuột vận động sẽ được ghi lại bằng máy và phần mềm ANY-maze

(Stoelting Co., Wood Dale, IL) trong 6 phút. Sau 6 phút, chuột được nhấc ra

khỏi bình nước, lau khơ và đưa trở lại chuồng ni. Tiêu chí đánh giá là thời

gian chuột ngừng cử động (được xác định là không có hành động gì ngồi hoạt

động hơ hấp và thả tự do nổi trên nước) trong 4 phút cuối.



30



Hình 2.5: Mô bơi cưỡng bức FST

2.3.2. Đánh giá tác dụng chống oxy hố của cao chiết ethanol tồn phần

2.3.2.1.



Phương pháp đánh giá hoạt tính dọn gốc DPPH



Phương pháp DPPH là phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của

bất kỳ hợp chất nào tiến hành trên mơ hình in vitro.

Ngun tắc: DPPH (1,1-Diphenyl – 2-picrylhydrazyl) là gốc tự do ổn định

có thể nhận một electron hoặc một gốc hydro thành một phân tử nghịch từ ổn

định. Dung dịch methanol hòa tan DPPH hấp thụ cực đại ở bước sóng 517 nm.

Gốc DPPH phản ứng với chất khử hóa phù hợp tạo khung mới, do đó dung dịch

có màu tím. Dung dịch mất dần màu khi tăng nồng độ chất chống oxy hóa bằng

cơ chế các chất chống oxy hóa lấy electron từ gốc DPPH. Phương pháp này để

đánh giá khả năng dọn dẹp gốc tự do của hợp chất/cao chiết từ thực vật.



Hình 2.6: Phản ứng của gốc DPPH với các gốc khác (•R= •H, gốc alkyl,…)

31



Cách tiến hành: Phương pháp đánh giá được tiến hành theo mô tả của tác

giả Manzocco và cộng sự 1998, dịch chiết được hoà trong methanol và pha dung

dịch DPPH trong methanol với nồng độ 0,5 mM. Các giếng phản ứng chuẩn bị

như trong bảng 2.1:

Bảng 2.1: Hỗn hợp phản ứng

Ống

Trắng

Chứng

Trắng (thử)

Thử



Dung dịch thử (µl)

10,0

10,0



MeOH (µl)

100,0

10,0

90,0

-



Dung dịch DPPH (µl)

90,0

90,0



Lắc nhẹ đĩa ELISA, để ổn định ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Sau 30

phút, đo độ hấp phụ ở bước sóng 517 nm. Hoạt tính dọn gốc tự do của mẫu

nghiên cứu được tính bằng công thức:

% 𝐷𝐷ọ𝑛𝑛 𝑔𝑔ố𝑐𝑐 𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷 = 100% −



Abs: mật độ quang



2.3.2.2.



𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 (𝑡𝑡ℎử)

𝑥𝑥 100%

𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴(𝑐𝑐ℎứ𝑛𝑛𝑛𝑛) − 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 (𝑡𝑡𝑡𝑡ắ𝑛𝑛𝑛𝑛)



Phương pháp đánh giá hoạt tính dọn gốc Superoxide



Mặc dù anion superoxide có tính oxy hố kém, nhưng nó lại sản sinh ra gốc

hydroxyl có hoạt tính rất mạnh tương đương với ngun tử oxy, cả hai đều gây

ra những stress oxy hoá [62].

Nguyên tắc: Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ các gốc tự do đã sinh ra

của chất nghiên cứu qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxide O•2 . Gốc



superoxide được tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxidase sẽ

được định lượng bằng phương pháp khử sử dụng nitroblue tetrazolium (NBT)



cho phức chất có màu tím được đo quang ở bước sóng λ = 550 nm. Hoạt tính

chống oxy hóa cảu mẫu thử dược thể hiện qua việc làm giảm sự hình thành phức

màu tím (Hình 2.7).



32



Hình 2.7: Tính khử của NBT khi phản ứng với gốc anion superoxide tạo

ra bởi phản ứng của PMS-NADH

% 𝐷𝐷ọ𝑛𝑛 𝑔𝑔ố𝑐𝑐 𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠 = 100% −



Phương pháp tiến hành



𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 (𝑡𝑡ℎử)

𝑥𝑥 100%

𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 (𝑐𝑐ℎứ𝑛𝑛𝑛𝑛) − 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 (𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑚𝑚ơ𝑖𝑖)



Đánh giá hoạt tính dọn gốc anion superoxide bằng phương pháp của tác giả

Robak và Gryglewski (1988) [35]. Gốc tự do anion superoxide được hoà trong

3,0 mL đệm Tris–HCl (16 mM, pH 8,0), chứa 0,5 mL of nitroblue tetrazolium

(NBT) (0,3 mM), 0,5 mL NADH (0,936 mM); 1,0 mL dịch chiết mẫu và 0,5 mL

đệm Tris–HCl (16 mM, pH 8,0). Phản ứng xảy ra khi thêm 0,5 mL phenazine

methosulfate (PMS) (0,12 mM). Thành phần cho 1 giếng trong đĩa ELISA như

sau:

Bảng 2.2: Thành phần cho một phản ứng

Thành phần

Tris HCl

NADH

NBT

H2O

Mẫu



Trắng (µl)

25,0

25,0

75,0

-



PMS



25,0



Chứng (µl)

25,0

25,0

25,0

50,0 µl dung

mơi

25,0



Trắng (thử) (µl)

25,0

25,0

25,0

50,0



Thử (µl)

25,0

25,0

25,0

50,0



25,0



25,0



Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 5 phút và đo độ hấp thụ ở bước sóng

560 nm.

2.3.3. Định lượng hàm lượng BNIP3 trong não

33



2.3.3.1.



Tách chiết ARN



Nguyên tắc: ARN được tiến hành chiết tách gồm các bước cơ bản tương tự như

ADN (bao gồm phá vỡ màng tế bào, loại protein, tủa ARN) nhưng ở đây ta dùng

enzyme desoxyribonuclease (ADNse) để phân huỷ ADN. Do ARN kém bền và

dể bị phân huỷ bởi enzyme ribonuclease (ARNse) có nhiều ở khắp nơi, hoạt tính

cao lại bền với nhiệt (trên 90°C), vì vậy, điều kiện thao tác để chiết tách phải

được tiến hành trong môi trường vô cùng nghiêm ngặt. Phương pháp chung để

tách ARN tổng số được tiến hành như sau:

1.



Phá màng tế bào: tế bào, mô được lấy mẫu và nghiền trong dung dịch

chứa các chất tẩy mạnh như SDS ở nồng độ cao kết hợp với 2 tác nhân

gây biến tính protein mạnh và hiệu quả, đó là Guanidinium thiocynate và

2 mercaptoethanol. Hai chất này có tác dụng ức chế hoạt động của các

ARNse nội bào và tách cá protein liên kết ra khỏi ARN.



2.



Loại protein: bằng cách xử lý phenol:chloroform à li tâm à tủa protein và

cặn bã



3.



Tủa ARN: thêm lượng ethanol dư thừa.

Phương pháp tiến hành:

Tách chiết ARN tổng số theo protocol chuẩn theo kit Trisure (Bioline).



2.3.3.2.



Phiên mã ngược tạo cADN



Ngun tắc: Vì acid ribonucleic (ARN) khơng thể đóng vai trò làm khn

mẫu trực tiếp cho PCR nên cần kết hợp bước phiên mã ngược (reverse

transcription – RT) với PCR để ARN được chuyển thành ADN bổ trợ (cADN)

và trở thành khn mẫu thích hợp cho PCR. Khi hai kỹ thuật này được kết hợp

với nhau, ngôn ngữ chuyên ngành và giao tiếp hàng ngày gọi đó là phản ứng

chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR).

Phương pháp tiến hành:



34



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×